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mRNA 工程的遗产——诺贝尔奖的先驱者阵容

核酸研究介绍

mRNA-based medicines

DNA的发现

前两个世纪以阐明核酸的结构和功能为标志。弗雷德里希·米歇尔首先于 1869 年分离出核蛋白。核酸这个名称是创造出的新词, 19 世纪末阿尔布雷希特·科塞尔将其分为五个碱基:腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、 胸腺嘧啶和尿嘧啶。又过了半个世纪,奥西瓦德·艾弗里发现脱氧核糖核酸 (DNA) 与遗传有关,从而为分子生物学遗传学奠定了基础。此外,夏尔加夫关于某些碱基的固定比例这一生化发现,以及富兰克林的晶体学研究推动沃森和克里克在 1953 年发现DNA 的结构和功能。然而,RNA的作用及其与 DNA 和蛋白质的联系仍不清楚。

DNA discovery

mRNA的发现

戈尔德斯坦和普劳特在变形虫中观察到核转移,以及随后核糖体和转移 RNA的鉴定表明了RNA 合成在1950 年代中期所处的位置。直到 1960 年代初,大量工作才证明了第三种类型的 RNA——可溶但寿命短的信使 RNA (mRNA)。当时发表的两篇Nature文章中的结果证明了mRNA是一类全新的RNA。同时期也有其他大小类似且附着在核糖体上的 RNA 分子被证明。一篇讲述 DNA 和瞬时 RNA 互补性的文章进一步解决了从 DNA 到蛋白质的编码转移难题。在 1964 年,查尔斯·亚诺夫斯基报告了基因结构和蛋白质结构的共线性。尼伦伯格在 1966 年阐明了遗传密码及其在蛋白质合成中的作用,并于两年后获得了诺贝尔奖。就这样,mRNA探索的时代展开了。

RNA discovery

寡核苷酸合成

核酸是遗传信息来源的发现迅速推动了导致合成密码产生的科学研究,从 1955 年迈克尔逊和托德化学合成二核苷酸开始。通过科拉纳等人在 1960 年代早期引入的一种新的磷酸二酯方法,包括保护核糖核苷中的 2' 和 5'-羟基基团以及随后的缩合,可以合成更长的寡核苷酸链。寡脱氧核糖核苷酸由于其稳定性和在遗传信息存储中的作用成为研究的焦点。合成寡核苷酸对于破解遗传密码至关重要。这种方法足以进行寡脱氧核糖核苷酸的合成,随后可以将其加入双链 DNA 中,作为第一个具有生物学意义的 RNA 分子的模板:1970 年的丙氨酸转移核糖核酸。然而,缺乏磷酸盐保护导致寡核苷酸链产生分支,想要改变这一状况需要在每个步骤中进行费力的纯化任务,因此试图合成更长的寡核苷酸是不切实际的。勒辛格在 1960和1970 年代引入的磷酸三酯固态方法解决了科拉纳方法的缺陷。这种方法作为第一个寡核苷酸合成器的基础,足够简单且可以快速复制。然而,逐步效率和长耦合时间使得将核苷酸链延伸超过 20个碱基变得复杂。卡拉瑟斯通过用无机方法取代惹事生非的多聚体并用胺取代一个氯基团来进行微调, 这对于促进大规模核酸生产而言是必要的,因为亚磷酰胺可以提前制备、储存并在使用前轻松激活。

Oligonucleotide synthesis

mRNA的生产

早在 1950 年代就实现了使用多核苷酸磷酸化酶和核糖核酸酶A 促进合成寡核糖核苷酸,并在 1960 年代得到进一步发展。从核苷 2'-O-苄基醚化学合成寡核糖核苷酸提供了另一种选择。1969 年核糖核酸酶 T1 的应用允许酶促合成具有确定碱基序列的寡核糖核苷酸。同年报道了一种依赖 DNA 的 RNA 聚合酶分离方法。然后,1973 年证明了基于 DNA 模板的短核糖核苷酸的体外生产。两年后报道了逐步酶促寡核糖核苷酸的合成,包括修饰的核苷酸。然而,在关键的体外蛋白质合成发现之前,这些核糖核苷酸都不能用于蛋白质生产。

与此同时进行的对 mRNA 结构的研究成果结合上述合成发展成果,使 mRNA生产成为可能。在对呼肠孤病毒的研究中发现单链、富含腺嘌呤的 RNA 对应于 mRNA 的 poly-A 尾。随后确定了真核mRNA的翻译需要一个5'-末端7-甲基鸟苷帽,并表征了真核mRNA的翻译起始区。1983年,使用 SP6 噬菌体启动子进行首次体外合成的功能性 mRNA 作为模板和 SP6 聚合酶与人类基因进行了融合。近十年后,报道了基于 mRNA 的直接体内基因转移到小鼠肌肉。然而,由于蛋白质产生的持续时间较短以及可能引发免疫反应,相关研究受到了一定阻碍。

核苷酸和核苷修饰

首先,科学家们以寻找烷化剂的治疗靶点为目的对核苷修饰进行了初步研究。1964 年的后续研究揭示了氨基脲对 RNA 中胞苷残基的选择性修饰。随后出现了大量类似的研究。然而,这些研究工作大部分都针对 rRNA。因此,针对人工修饰与自然发生的 RNA 修饰的研究同时进行,这些修饰在 tRNA、rRNA、mRNA、snRNA和其他小 RNA中最常见。有趣的是,tRNA 核苷酸修饰有助于提升密码子依赖的核苷酸聚合速度,这是生物变异性的另一个来源和调节细胞功能的机制,为 mRNA 密码子优化以加速蛋白质生产提供了机会。

Toward mRNA synthesis

核苷酸修饰的转化生物学作用

核苷酸和核苷修饰有利于推动mRNA 作为治疗剂被广泛应用。它们也构成了 mRNA 发展史上最重要的一页。其中要解决的两个重点是:转化功效和免疫原性。这些领域的开创性工作对 mRNA 的巨大成功贡献最大,包括高效的 COVID-19 疫苗。出于多种原因,mRNA 翻译的功效至关重要。而越高的转化功效需要的mRNA 负载就越低,从而有助于降低免疫原性。侧翼 mRNA 区域是翻译功效最关键的调节因子。早在 1981 年, m7G5'p 的甲基酯化就被证明能够可逆地阻断其作为真核 mRNA 5'-帽类似物的活性。然而,在体外转录的过程中,多达一半的传统 m7GpppG 帽以相反的方向结合到 mRNA 中并导致功能丧失。2001年,抗反向帽类似物 (ARCA) 作为解毒剂问世,这是一种能够克服上述限制并始终以正确方向结合的新类似物。ARCA已在过去二十年中被广泛使用并显示出色的效果。最初,科学家们认为ARCA只是使翻译效率翻倍,但一项关于树突状细胞脂转染的研究结果显示它将翻译效率提高了 20 倍并与 Poly(A) 尾从 64 延伸至100个腺苷协同作用,进一步将效率增加到35倍,最终报告基因的产量总共增长了 700 倍。因此,ARCA 在随后的二十年中作为一系列新帽类似物的设计灵感和基础存在。基于 ARCA 概念的硫代磷酸酯帽类似物已获得专利,并由 BioNTech(设计抗 COVID-19 疫苗)独家收购用于其研究。直到最近,TriLink 才用共转录 CleanCap® 类似物合成 Cap 1 mRNA,其反应效率高于酶促反应,这对于需要在很短的时间内产生大量 mRNA 的情况尤为重要。因此,四十年来对帽类似物的研究使 mRNA 分子具有出色的效率和稳定性,使其具备广泛的治疗用途。它也是推动科学发展的动力来源。

除了翻译效率方面的问题外,mRNA 的免疫原性很快降低了人们对将基于 mRNA 的药物快速转化为临床实践的热情。然而,Kariko 博士的研究结果证明,将假尿苷掺入 mRNA 可防止静脉内给药后以全身性干扰素-α (IFN151 α) 尖峰形式出现的即时免疫反应。此外,假尿苷还通过不太显著地激活 RNA 依赖性蛋白激酶 (PKR) 来增强翻译,然后磷酸化翻译起始因子 2-α (eIF-2α) 并抑制含尿苷转录物的翻译。RNA 中的核苷修饰也限制了 2'-5'-寡腺苷酸合成酶的激活,并增加了对另一种细胞传感系统中核糖核酸酶 L切割的抵抗力。在假尿苷生产的生物过程中的修饰能够进一步消除杂质从而减弱治疗性 mRNA 的免疫激活特性。假尿苷和 ARCA 的掺入显著增加了产量,改善了 modRNA 的翻译并降低了其体外免疫原性。因此,用修饰的核苷酸装饰粗mRNA能够提高生物体对其的兼容性。目前在核苷酸修饰的研究方面已经达到了一定水平,mRNA 也成为适用于包括疫苗、蛋白质补充和干细胞工程在内的多个领域的药物,十分有前景。

DECORATED mRNA

基于 mRNA 的药物的生物学角色

a) 疫苗

疫苗是公共卫生不可或缺的工具并在医学中占有重要地位。然而,由于疫苗通常用于大量健康人群,因此它们的功效和安全性要求非常严格。早期使用减毒或灭活微生物的方法非常有效,但安全问题存在争议,且生产、纯化和质量控制既麻烦又昂贵。基于蛋白质的疫苗虽然缺点较少,但需要免疫佐剂且可能唤醒休眠的自身免疫。此外,基于 DNA 的疫苗受到进入细胞和核的阻碍以及需要额外设备来支持这一过程的困扰。最近通过将 DNA 包装到无害病毒中的方法解决了这一问题,但它仍然具有争议。无论哪种方法几乎都需要活的或结构完整的生物体来生产,使得开发速度更慢、成本更高。在这种背景下,使用 mRNA 的概念似乎是疫苗开发中的圣杯。只需在对微生物遗传物质进行测序并简单地模拟受体结合域 (RBD) 的核苷酸序列,然后在机器人工厂中合成它们,就可以在几天内得到mRNA 疫苗。因此,从微生物发现到临床级候选疫苗的时间跨度极短。整个过程的简单性还允许对初级疫苗进行快速反应和轻松调整,以应对微生物的遗传漂移和变体的形成。此外,不存在异种材料污染的风险,这让公众放心。综上这些特征似乎有利于 mRNA 作为理想的疫苗解决方案。

b) 蛋白质补充

由于蛋白质是所有生物体细胞内和细胞外部分的关键分子,它们的丢失或异常通常会导致疾病。补充蛋白质是一种有效的治疗方法。虽然有多种方法来传递蛋白质,例如基于病毒的基因替代或直接进行蛋白质传递,但人们对使用 mRNA 来实现这一目标的兴趣也越来越大。与 DNA 不同,mRNA 不与基因组整合,这避免了许多安全问题。在物理化学上所有的 mRNA 分子都相对相似,因此相同的配方可能服务于许多基因。同时,蛋白质特性的巨大差异导致每种蛋白质的配方和递送都需要单独开发。与疫苗相比,用于蛋白质补充的 mRNA 的制备要求更高。虽然在疫苗应用中欢迎宿主免疫反应的诱导,但最重要的是防止为蛋白质补充而递送的 mRNA 的免疫原性,特别是因为蛋白质补充可能在整个生命周期内给予,而免疫原性材料可能会导致慢性炎症。

c) 基于 mRNA 的细胞工程

干细胞和免疫细胞疗法正在成为医学研究的重要领域,而细胞工程经常用于增加治疗潜力。通过施用 mRNA 可以实现多种细胞功能。同时该技术对于瞬时细胞修饰至关重要。基于 mRNA 的细胞工程可以很好地解决细胞运输和迁移问题。研究表明粘附分子整合素α4(ITGA4)可以在编码mRNA后在间充质干细胞(MSCs)的表面上表达。通过编码CXCR4 的 mRNA 在体外也增加了 MSC 迁移。同样的策略也能够增强自然杀伤细胞的归巢。活性免疫分子的表达是基于 mRNA 的细胞工程的另一大领域。将嵌合抗原受体 (CAR) 或 T 细胞受体 (TCR) 的 mRNA 用于淋巴细胞可产生有效的免疫细胞。而其短暂的性质可以通过多次输注来克服,此外短期表达可以防止由于免疫细胞自身攻击而导致的严重并发症。基于 mRNA 的技术也非常适合基因组编辑。Cas9 酶也可以与相关的指导 RNA (gRNA) 序列一起以 mRNA 的形式传递给细胞。mRNA 也是在体细胞中诱导多能性的可行策略。

mRNA DELIVERY



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