3BDO可在体外和体内成功抑制胶质母细胞瘤的生长

背景

胶质母细胞瘤 (GBM) 是一种高级别胶质瘤，具有侵袭率高和突袭生长率高的特点。尽管外科和药物治疗方式已经有所发展，但GBM患者在诊断后仍然只有极少部分能够存活超过 15 个月。目前，替莫唑胺（TMZ）是GBM化疗的主要一线药物，但其易产生耐药性。因此，确定其他有更好疗效的药物来治疗 GBM迫在眉睫。

癌症的复发和转移通常归因于癌症干细胞 (CSC)，它们具有通过抵抗标准化疗和放疗方案来再生肿瘤的能力。大多数癌症已被证明含有 CSC，包括GBM。GBM中的CSC被称为神经胶质瘤干细胞 (GSC)，且已被证明能够进行多向分化、自主更新和广泛增殖并作为GBM生长的关键分子发挥作用。此外，上皮-间质转化（EMT）是正常上皮细胞获得间质表型的机制。细胞EMT是癌症发展的基础，这一过程增加了单个癌细胞的运动性，并允许它们侵入上皮连接处和细胞外基质。关于GBM的多项研究都表明EMT样程序的激活可增强恶性细胞的迁移和侵袭，并且侵袭性GBM和预后不良的患者总是表现出间充质标志物水平升高。因此，GSC和EMT抑制或许是GBM可行的治疗手段。

生存素（Survivin）是一种与细胞凋亡抑制相关的蛋白质。越来越多的研究发现，与正常中枢神经组织相比，神经胶质瘤细胞中的生存素表达水平显著升高，并且生存素表达与病理性胶质瘤分级呈正相关。此外，生存素表达的升高促进了EMT 和干性过程。3BDO是一种mTOR激活剂，起到自噬抑制剂的作用。研究表明3BDO暴露能够显著减少APP/PS1转基因小鼠中自噬体的数量并改善小鼠的记忆功能。此外，3BDO通过mTOR失活部分逆转了缺乏Rheb1的中性粒细胞的成熟。同时越来越多的证据表明3BDO可以作为mTOR调节剂独立发挥作用。例如，3BDO可减轻斑块内皮细胞死亡并减缓小鼠动脉粥样硬化的形成，但其方式不依赖于自噬或mTOR活性。3BDO也已被证明在体内和体外都可作为炎症抑制剂。当与DPB联合使用时，3BDO也被证明可以抑制癌细胞的生长。然而，尚不清楚3BDO是否在GBM中发挥潜在的抗癌特性。

来自中国的科学家们通过一系列体外和体内的实验验证3BDO能够成功抑制GBM中的EMT和干性过程。该研究不仅将 3BDO确定为一种潜在的GBM药物， 而且为 GBM治疗的新方法提供了理论基础。该文章发表于Journal of Cancer。

结果

3BDO抑制GBM细胞的增殖、迁移和侵袭

如图1 A-B，处理24小时后，3BDO以剂量依赖性方式抑制U87和U251细胞的生长。同样，3BDO也以剂量依赖性方式抑制细胞的集落形成能力（图1C-D）。研究者接着使用 transwell 侵袭实验观察了用3BDO处理过的细胞的侵袭和迁移能力。结果显示与未处理组相比，3BDO处理组以剂量依赖性方式表现出较低的细胞侵袭和迁移率（图1 E-H）。这些体外研究结果强烈支持3BDO能够抑制GBM细胞的增殖、侵袭和迁移。

3BDO降低EMT标志物的表达并抑制GBM细胞中生存素的表达

暴露于50μM或100μM剂量的 3BDO 24小时导致神经钙黏素、波形蛋白和snail蛋白的表达水平低于0μM组（图1 I-M）。同时，3BDO在U87和U251 细胞中以剂量依赖性方式降低生存素的表达水平。

图1. 3BDO可降低GBM细胞中EMT相关分子和生存素的侵袭、迁移和增殖能力及表达。

3BDO抑制细胞生长并下调GSC中生存素和干性标志物的表达

GBM的发生和发展归因于GSC的作用。因此，将GSC作为GBM的治疗靶点具有合理的科学依据。研究者首先将GSC在成球培养基中培养，并用不同浓度的3BDO处理72小时。如图2 A-B，3BDO治疗以剂量依赖性方式减少GSC球体的数量。此外，sox2是GSC干性的重要标志物。研究者发现随着3BDO浓度的增加，sox2的表达水平下降（图2 C-D）。接下来，他们通过蛋白质印迹分析来量化干性标志物的表达，例如巢蛋白、CD133和sox2。结果表明，在用指定剂量的3BDO孵育24小时后，上述干性标志物的表达水平下调。此外，3BDO在GSCs中以剂量依赖性方式降低生存素的表达水平（图2 E-F）。

图2. 3BDO抑制细胞生长并下调GSC中生存素和干性标志物的表达。

生存素的过表达可降低3BDO对GBM细胞和GSCs的影响

U87和U251细胞在3BDO中或溶媒中孵育24小时之前被人工诱导并过表达生存素。在生存素过表达的情况下，GBM细胞的增殖、迁移和侵袭能力增加（图3 A-F）。同时，生存素上调增加了EMT标志物的表达，包括神经钙黏素、波形蛋白 和 snail蛋白（图3 G-J）。此外，生存素的过表达还降低了3BDO对GBM细胞的抑制作用。

图3. 生存素的过表达可降低对3BDO诱导的细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用。

多项研究报告称，生存素在GBM组织和人源性GSC培养物中大量表达。在GSC生长期间， 体内和体外的生存素下调都被消除。而生存素的过表达增加了形成的球体的数量并使干性标志物上调，例如巢蛋白、CD133和sox2。此外，生存素的过表达可降低3BDO对球体形成的影响和GSC中干性标志物的上调（图4）。这些结果表明，3BDO通过抑制GBM细胞中生存素触发的EMT和通过对GSC发挥抗干性作用来发挥抗肿瘤作用。

图4. 生存素的过表达降低了3BDO对GSCs的影响。

3BDO抑制U87异种移植小鼠模型中的GBM生长

与未处理组相比，3BDO治疗（80 mg/kg/天）超过25天导致肿瘤重量和体积显著降低（图5 A-C）但未影响小鼠体重（图5 D）。此外，在从U87异种移植小鼠解剖的肿瘤中，内源生存素、snail蛋白、神经钙黏素、波形蛋白和 GSC 标志物（如巢蛋白、sox2和CD133）的表达被3BDO抑制（图5 E-F）。这些发现与体外一致，表明在胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型中3BDO通过抑制生存素介导的EMT和干性过程来抑制肿瘤生长， 突出了其作为治疗性GBM候选物的潜力。此外，为了检测药物的肝肾毒性，研究者在实验结束时取小鼠的肝和肾做成切片并进行染色。结果发现对照组和3BDO组小鼠的肝肾均未发生损伤（图5 G）。

图5. 3BDO 减少异种移植小鼠模型中神经胶质瘤的生长。

总的来说， 研究者们证明了3BDO在体内和体外都能够成功抑制GBM中的EMT和干性过程，并且确定生存素为3BDO的潜在目标。他们还首次使用皮下神经胶质瘤模型证明了3BDO能够发挥抗GBM特性， 这与其在体外实验中证明的作用机制一致。此外，小鼠总体重以及肝肾组织病理学并无显著变化证实了3BDO具有良好的耐受性。因此，3BDO是治疗GBM的潜在治疗药物。

参考文献

Wang Z, et al. 3BDO inhibits the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and stemness via suppressing survivin in human glioblastoma cells. J Cancer. 2022 Jan 16;13(4):1203-1213.