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酿脓链球菌外毒素B可裂解GSDMA和引发细胞焦亡

酿脓链球菌,又称为A群链球菌(GAS),会引起各种各样的急性感染,包括局部化脓性感染到严重的、甚至是致命性的侵袭性疾病。全身传播通常是由咽部的上皮屏障或受损皮肤的细菌渗透引起的,如果控制不好,会导致血液和软组织的侵袭。GAS的浅表定植和侵袭性感染取决于分泌的GAS毒力因子,其中半胱氨酸蛋白酶外毒素(SpeB)是关键。SpeB初始为无活性的酶原,通过蛋白水解转化为成熟的催化活性酶。SpeB有助于表皮的定位和全身传播,但是其中的深层次的机制未知。

Gasdermins由人类中的五种旁系同源基因(GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD和GSDME)编码,是一个成孔蛋白家族,可作为细胞焦亡的关键。在识别出侵入性细菌或其他危险信号后,先天免疫受体组成称为炎症小体的大型超分子复合物,可激活炎性半胱天冬氨酸,裂解GSDMD并释放N末端。GSDMD-NT在细胞膜中组装,形成孔道并引发细胞焦亡。单个gasdermins在特定的粘膜部位选择性表达,其中GSDMA主要在皮肤和上消化道的上皮细胞中表达。但是GSDMA是如何被激活仍然未知。近日,刘星团队在Nature发文,对GAS感染的应答机制进行了报道。

SepB可诱导皮肤的上皮细胞溶解性死亡:

为了研究宿主细胞对GAS感染的反应,研究者用以下不同分型的GAS株对小鼠进行感染:野生型WT M1T1株、等基因突变株(ΔcepA、Δmac或ΔspeB)和动物传代的covR/S-株。结果发现,SpeB正常表达的GAS WT、ΔcepA、Δmac在皮肤感染部位引起严重的化脓性和坏死性病变,而GAS SpeB缺失的ΔspeB、covR/S-株则无明显反应(图1a、b)。GAS WT、ΔcepA、Δmac突变株感染的小鼠,上皮完整性被破坏,且中性粒细胞浸润增加,而ΔspeB、covR/S-突变株感染的小鼠相比前者组织损伤和中性粒细胞浸润都显著性减少(图1c、d)。但是后者出现更严重的全身感染,脾脏和肝脏的细菌负荷显著性增加,更容易发生死亡。将SpeB重新加入ΔspeB突变株感染的小鼠,可恢复GAS诱导的皮肤损伤,增加中性粒细胞浸润并减少由GAS ΔspeB感染引起的全身性感染,证实了SpeB在GAS M1T1感染中的作用。

为了研究SepB在GAS感染期间是如何发挥其功能的,研究者分离了原代小鼠的角质形成细胞并用GAS菌株进行感染。结果发现,GAS WT、ΔcepA、Δmac感染可导致大量的角质形成细胞死亡,有典型的焦亡气球样形态和乳酸脱氢酶(LDH)的释放,而ΔspeB、covR/S-突变株感染的没有(图1e、f)。为了进一步评估SpeB在细胞死亡的作用,引入了重组的SpeB及其无催化活性的突变体C192S (mSpeB)通过电穿孔进入小鼠原代角质形成细胞。WT SpeB的电穿孔可有效地导致细胞死亡,具有细胞焦亡的特征——细胞膜膨胀和LDH释放,而mSpeB无该现象(图1g、h)。因此,这些数据表明SpeB为皮肤上皮细胞溶解性死亡的潜在触发器。

Epithelial cell lysis death

图1 GAS SpeB引发皮肤上皮细胞裂解性死亡

SpeB触发GSDMA依赖性的细胞焦亡

为了验证GSDMA的作用,研究者使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑来敲除A431细胞中的GSDMA。与SepB转染诱导的WT细胞相比,GSDMA缺失的细胞对SpeB引发的裂解细胞死亡具有高度抗性(图2c、d)。同时,只有GSDMA或只有SpeB都不能改变缺乏内源性GSDMA的293T细胞的形态和活力,而GSDMA与SpeB的共表达可导致细胞焦亡,发生气球样形态和大量LDH释放(图2e,f)。值得注意的是,mSepB和GSDMA的共转染不会导致细胞死亡;半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64可完全消除SpeB引发的细胞焦亡,而半胱天冬氨酸酶抑制剂(Z-WEHD-fmk、Z-DEVD-fmk和Z-VAD-fmk)不可以。因此,催化活性SpeB诱导GSDMA依赖性但不依赖于半胱天冬氨酸酶的焦亡。

GSDMA triggered cell scorch

图2 SpeB以依赖GSDMA的方式触发细胞焦亡

SpeB在Gln246后切割GSDMA

研究者还发现,与mSpeB相比,GSDMA与WT SpeB的共表达可产生切割的N末端片段(GSDMA-NT),在半胱氨酸酶抑制剂E64存在时未能检测到,而在半胱天冬氨酸酶抑制剂存在时可检测到(图3a)。体外切割实验表明,与mSpeB相比,重组GSDMA用WT SpeB以剂量依赖性方式处理,可产生GSDMA的N端p27和C端p23片段(图3b),在半胱氨酸酶抑制剂E64存在时未能检测到(图3c)。SpeB和gasdermins在293T细胞的共表达表明SpeB可特异性切割GSDMA,而对于GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME无法切割(图3d)。GAS WT、ΔcepA、Δmac感染的A431细胞会导致GSDMA裂解,但不会导致GSDMD、GSDME裂解,并在ΔspeB、covR/S-突变株感染后未检测到裂解的gasdermins(图3e)。这些数据表明GSDMA显示出对SpeB反应的特异性,且不会被其他蛋白酶不加选择地切割。

研究者还用Edman测序,发现SpeB在GSDMA链接区域的Q246之后切割GSDMA。为了确认I245/Q246作为切割位点,研究者利用I245N、Q246E和I245N/Q246E GSDMA突变体并测试其对SpeB的敏感性(图3f、g)。I245N和I245N/Q246Q突变体GSDMA可完全抵抗SpeB介导的切割,而Q246E突变体仍然被切割。因此,SpeB在Gln246后直接和选择性地切割连接区域的GSDMA。

Unplug Fan Sijia's DMA

图3 SpeB在Gln246后切割GSDMA

SpeB切割的GSDMA-NT导致细胞焦亡

为了进一步探讨GSDMA裂解在SpeB引发的细胞焦亡中的作用,研究者将WT或催化死亡的SpeB引入表达WT GSDMA或GSDMA(I245N/Q246E)的293T细胞中,不被SpeB切割,并评估GSDMA裂解和细胞焦亡。只有WT SpeB和WT GSDMA转染的细胞中发生GSDMA裂解、细胞焦亡和LDH释放(图3h、i),表明SpeB介导的GSDMA裂解对于SpeB诱导的焦亡是必要和充分的。为了确定GSDMA的SpeB切割产物在SpeB诱导的细胞焦亡中的作用,研究者用SpeB处理重组全长GSDMA并将其纯化的GSDMA-NT和C端(GSDMA-CT)反应产物通过电穿孔导入293T细胞中。结果发现,纯化的GSDMA-NT或GSDMD和caspase-11(阳性对照)的电穿孔可导致严重的细胞焦亡,全长GSDMA或GSDMA-CT的电穿孔对细胞活力没有影响。因此,SpeB切割的GSDMA-NT仅在细胞内才会诱导细胞焦亡。

GSDMA-NT破坏酸性脂质膜

为了更好地了解GSDMA-NT如何导致细胞焦亡,研究者利用包含残基1-214(GSDMA1-214)或1-246(GSDMA1-246)标记的GSDMA片段。蛋白质-脂质覆盖测定显示GSDMA1-246与磷脂酰丝氨酸(PS)、3-O-磺基半乳糖基神经酰胺和心磷脂(CL)紧密结合。全长的GSDMA和GSDMA1-214不与条带上的任何脂质结合,而GSDMA1-246与含有PS或CL的磷脂酰乙醇胺(PE)-磷脂酰胆碱(PC)脂质体结合,但不与仅含有PE和PC的脂质体结合。当与交联剂或脂质体一起孵育时,全长GSDMA作为单体存在,而GSDMA1-246形成低聚物。与mSpeB对比,GSDMA与SpeB一起孵育,以浓度依赖性方式透过含PS或CL的脂质体。同时重组GSDMA1-246,导致脂质体渗漏,而全长GSDMA或GSDMA-CT没有。因此,由SpeB裂解产生的GSDMA1-246结合并破坏酸性脂质膜。

破坏酸性脂质膜1Gsdma1的缺失会减弱抗GAS免疫力

小鼠基因组包含三个GSDMA同源物Gsdma1、Gsdma2、Gsdma3;其中,Gsdma1、Gsdma3在皮肤上选择性表达。Gsdma1与SpeB的共表达产生Gsdma1-NT,而SpeB不切割Gsdma3。在存在SpeB的情况下,WT Gsdmal1,可触发PS和CL脂质体的泄露,导致细胞焦亡。将重组SpeB通过电穿孔导入到covR/S-突变株感染角质形成细胞并没有像WT感染的发生细胞焦亡,证实了Gsdma1是导致小鼠细胞焦亡的SpeB底物。

接下来,研究者评估了GSDMA在宿主防御GAS感染的体内作用。与WT小鼠不同,Gsdma1-/-感染的小鼠无严重的皮肤坏死病变,上皮完整,几乎无浸润的中性粒细胞(图4c-e)。在WT GAS感染的小鼠皮肤损伤中检测到Gsdma1切割,但是ΔspeB感染的未检测到(图4f)。Gsdma1-/-感染的小鼠角质形成细胞可观察到GAS,且Il6、Ccl2和Ccl5的mRNA水平显著降低(图4g),但是Gsdma1-/-感染的小鼠易发生更严重的全身性感染,脾脏和肝脏的细菌载量高出几个对数(图4h)。Gsdma1-/-感染的小鼠超过一半的在5天内死亡,而大多数(15/18)WT感染的小鼠幸存下来(图4i)。Gsdma1-/-感染的小鼠即使在更高浓度的GAS感染也没有出现皮肤坏死性损伤。且两者的脾脏细菌未检测到covR/S突变或其他调节基因突变,排除了潜在突变在细菌传播或全身发病机制中的作用。值得注意的是,WT和Gsdma1-/-小鼠对皮下Δ speB GAS感染、皮下金黄色葡萄球菌感染或腹膜内 WT GAS 感染同样敏感(图4c-e、g-i、j、k)。因此,SpeB介导的GSDMA裂解在宿主防御GAS M1T1感染中具有重要作用。

Weakening of immunity against GAS

图4 Gsdma1的缺失会减弱抗GAS免疫力

在这项研究中,研究者发现GSDMA既可作为感知GAS SpeB外毒素入侵的感受器,也可作为上皮细胞焦亡的效应器,增加了宿主免疫识别和对病原微生物感染作出反应的新机制。宿主细胞通过焦亡反应,可将细菌入侵和黏附的SpeB毒素进行转变,降低全身性感染的风险,同时,SpeB对GAS的定植和与其他微生物竞争定植十分重要。由于GSDMA在哺乳动物的广泛保护,提高了哺乳动物抵抗全身性感染的能力,因此研究GSDMA中有遗传变异的人是否更容易受到GAS感染将是一件有意义的事情。

参考文献:

Deng, W., Bai, Y., Deng, F. et al. Streptococcal pyrogenic exotoxin B cleaves GSDMA and triggers pyroptosis. Nature 602, 496–502 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-021-04384-4



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