新冠病毒感染可能会“完蛋”

近年来，由于受到疫情的影响，人们的工作和生活方式发生了天翻地覆的变化。其中，SARS-CoV-2是引起COVID-19流行的病毒，尽管COVID-19主要是呼吸道感染，但是也有报道，许多肺部以外的组织如嗅觉系统、生殖系统也受到了影响。有文献报道，与COVID-19相关的睾丸疼痛比预期更频繁。在一项研究中发现18名SARS-CoV-2感染的患者中有1名出现附睾不适。还有一项对COVID-19感染的男性死亡后的研究，发现睾丸炎伴有广泛的生殖细胞和Leyding细胞破坏。另有一项研究发现，4名急性COVID-19病例和2名恢复期COVID-19病例的精液标本在RT-PCR中呈现SARS-CoV-2阳性。但是SARS-CoV-2的感染是否会引起睾丸损伤仍不确定。近日，香港大学医学院在Clinical infectious diseases（IF=9.079）中报道,SARS-CoV-2感染可能会引起急性睾丸损伤，且随后会出现慢性不对称性睾丸萎缩和相关的激素变化。

鼻内SARS-CoV-2感染诱导急性睾丸损伤

研究者对雄性叙利亚黄金仓鼠鼻内接种10、102、103、105 PFU不同浓度的野生型SAR-CoV-2，肺炎组织变化与之前报道的一致（图1A）。没有发现任何的阴囊肿胀。在103或105 PFU感染后的4天（dpi），精子数量明显减少（图1B），睾丸外观、大小、重量无明显的病理变化（图1C、D）。与对照组相比，4 dpi和7 dpi时的血清睾酮和抑制素B水平明显降低（图1E）。这些研究结果与SAR-CoV-2感染急性期的亚临床睾丸损伤一致。

图1 鼻内SARS-CoV-2感染诱导急性睾丸损伤

鼻内SARS-CoV-2感染诱导慢性睾丸损伤

研究者发现，随着鼻内SARS-CoV-2感染的时间推移，120 dpi时睾丸的大小和重量明显减少（图2A、B）。在42和120 dpi时，精子数量也明显减少（图2C）。血清睾酮和抑制素B水平在120dpi时明显降低（图2D）。这些研究结果表明，在SARS-CoV-2感染后，睾丸和激素都发生慢性损伤。

图2 鼻内SARS-CoV-2感染诱导慢性睾丸损伤

SARS-CoV-2感染的急性睾丸损伤的组织病理学变化

对照组的睾丸正常组织结构显示出由多层生精上皮细胞整齐排列组成的生精管，管腔内有成熟的精子（图3A）。在105 PFU鼻内感染后1dpi，33%仓鼠由于水肿而睾丸体积发生增大。18.7%仓鼠观察到严重的睾丸出血和间质单核细胞浸润（图3B）。43.8%仓鼠发现严重的生精管坏死（偶见中性粒细胞），生殖细胞排列紊乱，生精细胞减少，多核生精细胞退化，甚至是管腔内精子耗竭（图3C）。在103 PFU鼻内感染后4dpi，47.06%仓鼠出现睾丸损伤，而105 PFU鼻内感染的睾丸损伤更严重。在7dpi时，103 PFU和105 PFU感染的仓鼠都出现了严重的睾丸坏死，一些生精管腔内只含有细胞碎片（图3D）。SARS-CoV-2感染后4dpi和7dpi的Johnsen评分明显降低，表明精子生成受到严重的影响。附睾有间质单核细胞浸润，管腔内有脱落的生精细胞和细胞碎片（图3F）。

图3 SARS-CoV-2感染的急性睾丸损伤的组织病理学变化

鼻内SARS-CoV-2感染后的Sertoli细胞和生精细胞的退化和坏死

正常组织中有长细胞质臂的支持细胞向位于曲细精管基底膜的管腔延伸，可滋养和支持有序生殖细胞分化。表达高水平细胞质波形蛋白的支持细胞从基底膜向内内腔呈辐射状规律分布（图4A）。在105 PFU鼻内感染后4dpi，可观察到表达波形蛋白的支持细胞的分布模式严重中断（图4B），支持细胞的细胞质空泡化、变性、脱落进入管腔。

在正常组织中，DAZL蛋白更多在初级精母细胞中表达，少数在精原细胞表达，在次级精母细胞和支持细胞中不表达（图4C）。在105 PFU鼻内感染后4dpi，DAZL染色显示生殖细胞排列紊乱，有初级精母细胞形成的DAZL阳性多核巨细胞，以及次级精母细胞形成的DAZL阴性脱落生殖细胞和多核巨细胞（图4D）。受影响的初级精母细胞和次级精母细胞伴有相邻支持细胞的气球样变化。间质Leydig细胞显示核浓缩，表明细胞凋亡（图4E）。

图4 鼻内SARS-CoV-2感染后的Sertoli细胞核生精细胞的退化和坏死

通过鼻内或直接睾丸内注射SARS-CoV-2的睾丸感染

与高度感染的肺部组织不同，在4、7、42、120 dpi时，只有少数睾丸样本发现低病毒量（图5A）。病毒N蛋白的免疫荧光染色显示，在4 dpi时，只有曲细精管的少数阳性细胞和附睾管腔中的脱落细胞（图5B）。精子涂片也显示有少数N阳性的脱落细胞（图5C）。

直接睾丸内注射SARS-CoV-2，在4dpi时，可诱发局部间质炎症浸润和节段性精管变性（图5D）。在1dpi和4dpi时，N蛋白很容易在间质和附睾上皮细胞中看到多个病灶，每个病灶含有3-5个免疫荧光阳性细胞（图5D、E）。研究还发现，在6个睾丸中有5个有可检测到的病毒负荷，而2个有亚基因组RNA（sgRNA）表达，因此SARS-CoV-2很可能在睾丸细胞中复制（图5F）。在1dpi和4dpi时，检测到睾丸中细胞因子/趋化因子mRNA明显增加（图5G）。与注射SARS-CoV-2相比，注射A(H1N1)pdm09后，睾丸中很少发现流感病毒抗原，尽管可以检测到少量的病毒和细胞因子/趋化因子的mRNA表达增加，但没有观察到组织病理学变化。因此，当睾丸直接暴露于SARS-CoV-2，睾丸细胞被感染，从而引发细胞因子/趋化因子反应和细胞损伤。

图5 通过鼻内或直接睾丸内注射SARS-CoV-2的睾丸感染

鼻内SARS-CoV-2感染睾丸中的炎症细胞因子/趋化因子mRNA和凋亡调控基因的表达

与对照组相比，只有部分仓鼠睾丸发生损伤。而105 PFU鼻内感染的仓鼠，其促炎症的细胞因子/趋化因子包括IFN-α、IFN-γ、IL-6、TNF-α CXCL10 (IP-10)、CCL3 (MIP1-α)、CCL5 (RANTES)明显升高（图6A）。死亡受体TRAIL和促凋亡基因PUMA的表达分别在103PFU和105PFU感染时发生明显的上调（图6B）。这些结果表明，炎症细胞因子反应与睾丸病变有关。TUNEL染色结果显示，对照组的TUNEL阳性细胞极少，而SARS-CoV-2感染的生精小管可发现多个TUNEL阳性细胞。在4dpi时，半定量的TUNEL阳性分数随着病毒接种量的增加而增加（图6C、D）。

图6 鼻内SARS-CoV-2感染睾丸中的炎症细胞因子/趋化因子mRNA和凋亡调控基因的表达

SARS-CoV-2感染慢性睾丸损伤的组织病理学变化

在103 PFU鼻内感染的42 dpi和120 dpi时，不同程度的生精上皮变性，包括杂乱的生殖细胞脱落细胞、充满管腔细胞碎片的生精小管坏死、严重生精细胞耗竭和精子丢失持续存在（图7A、B）。Johnsen评分表明，精子生成受到严重损害（图3E）。在42 dpi和120 dpi时，分别有57.1%和71.4%仓鼠出现睾丸组织病理学损伤，附睾管腔内只有少数甚至无精子，只有细胞碎片。意外的是，炎症细胞因子/趋化因子的mRNA水平与对照组相似（图7C）。然而，死亡受体基因TRAIL和促凋亡基因BAX表达仍然升高。在120 dpi时，显示出渐进的病理变化。TUNEL染色显示120 dpi的曲细精管比42 dpi的有更广泛的阳性信号（图7D、E）。小鼠抗仓鼠 IgG 的免疫荧光染色显示，在 7 至 120 dpi 时，坏死曲细精管的细胞表面有广泛染色，带有阳性补体成分 3 (C3) 的斑块，表明在 7 dpi 时免疫复合物沉积物与补体结合（图8A-F）。这些发现进一步表明血液-睾丸屏障被破坏，免疫复合物沉积可能导致睾丸损伤。

图7 SARS-CoV-2感染慢性睾丸损伤的组织病理学变化

图8 SARS-CoV-2感染慢性睾丸损伤的组织病理学变化

与普通流感病毒A(H1N1)pdm09相比，SARS-CoV-2变异株鼻内感染可诱导睾丸损伤

为了研究睾丸损伤是否SARS-CoV-2毒株特有的，研究者用103 PFU的Delta（B.1.617.2）和Omicron（B1.1.529）变异株分别对仓鼠进行鼻内感染。在4 dpi时，所有仓鼠都发生肺炎，并伴有支气管炎、肺泡炎和内皮炎，而Omicron感染的严重程度较低。在4dpi和7dpi时，有2/3的Delta和Omicron感染的仓鼠睾丸观察到不同程度的生精小管退化和坏死（图9A），精子数量明显减少（图9C）。在7 dpi时，Delta（B.1.617.2）和Omicron（B1.1.529）感染的仓鼠血清中睾酮水平明显减少（图9D）。在4dpi时，一些睾丸中可检测到病毒负荷（图9E）。而普通流感病毒A(H1N1)pdm09感染的睾丸没有任何组织病理学变化（图9F）。

图9 与A(H1N1)pdm09相比，SARS-CoV-2变异株鼻内感染可诱导睾丸损伤

疫苗接种可保护睾丸免受SARS-CoV-2感染的损伤

对仓鼠进行肌肉注射全病毒灭活疫苗2剂，其中间隔14天。在第二次接种后14天，103 PFU SARS-CoV-2鼻内感染，在4 dpi和28 dpi检测睾丸（图10A）。所有接种疫苗的仓鼠都能检测到中和抗体，GMT分别为160±43.82和120±23.09，无明显的组织病理学变化（图10B），表明疫苗接种可有效保护睾丸免受SARS-CoV-2感染的损伤。

图10 疫苗接种可保护睾丸免受SARS-CoV-2感染的损伤

讨论

该研究发现，雄性叙利亚黄金仓鼠作为COVID-19的生理性动物模型，在SARS-CoV-2感染的28 dpi时，睾丸发生损伤，精子数量急性减少，随后出现慢性不对称性睾丸萎缩，伴有少精症，血清睾酮和抑制素B持续偏低。在4-120 dpi期间，Leydig细胞、间质细胞和生精小管出现退化、坏死和炎症，精子生成被破坏。免疫组化结果显示，生精小管Sertoli细胞和生精细胞受到严重影响。在生殖细胞、间质和附睾上皮细胞发现少量的病毒N蛋白表达，且随着病毒接种量增加而增加。同时，与普通流感病毒A(H1N1)pdm09相比，SARS-CoV-2变异株鼻内感染导致睾丸损伤有特异性，而疫苗接种可保护睾丸免受SARS-CoV-2感染的损伤。

新冠疫情以来，人们的关注点大多放在疫情的防控上，对于SARS-CoV-2感染对生殖系统的损伤关注较少。该研究从动物水平上为SARS-CoV-2感染对男性生殖系统的损伤提供了证据，后续在临床上关于SARS-CoV-2感染对男性生殖系统的损伤需要进一步研究。

参考文献

Li C, Ye Z, Zhang AJ, et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infections by intranasal or testicular inoculation induces testicular damage preventable by vaccination in golden Syrian hamsters [published online ahead of print, 2022 Feb 18]. Clin Infect Dis. 2022;ciac142. doi:10.1093/cid/ciac142