β淀粉样蛋白并非阿尔兹海默症的真正诱因

      AD 在神经病理学上有两种病变定义：一是细胞内 tau 聚集体、细胞外 β-淀粉样蛋白等组成的神经炎斑块。二是包含未完全消化自噬底物的 AV 在疾病早期受影响的神经元内逐渐累积。其中，AD 中自噬功能障碍的分子基础以及与 APP/淀粉样蛋白病理学的关系及致病机理尚不清楚，部分原因在于以目前的技术去监测大脑内 的ALP 异常仍然具有挑战性。为了克服这些限制，研究者设计了一种转基因小鼠（TRGL）具有神经元特异性表达串联荧光标记 LC3（mRFP-eGFP-LC3 或 tfLC3），一种与 AP 和 AL 选择性相关的自噬衔接蛋白的能力。为了识别和监测与 AD 相关的 ALP 缺陷，研究者将 TRGL 和AD 模型小鼠交叉。这些AD模型小鼠具有发展为早发性或晚发性疾病病理的特性。

      出生后的小鼠神经元中特异性表达tfLC3，表达水平约比内源性LC3 水平高一倍，并且对ALP 没有可测出的影响。与内源性LC3 一样，tfLC3 与 AP 膜结合，并在AP-LY 融合后作为 AL 内降解的内化底物持续存在，最终产生非荧光 Lys。AP 上的 tfLC3 在 AP 的中性 pH值下发出黄绿色荧光，但 AL 与 LY 融合后的进一步成熟使AL酸化，导致荧光从黄色变为橙色，然后变为红色。荧光LC3 自噬清除后得到的 LYs或生物产生的全新LY 可以与带有第三荧光团标记的LY标记并通过免疫组织荧光(IHF)进行可视化。但是第三荧光团可以将发黄色荧光的AP 与与 LY 融合且组织蛋白酶阳性但未能充分酸化的 AP 区分开来，因此仅通过tfLC3 标记发出黄色荧光（图 1a）。

      当从 AP 到 AL 的转变在 TRGL 小鼠原代神经元培养中的逆行轴突运输过程中延长时，AP 成熟和酸化最容易被理解（图1b）。完全酸化的 AL 集中在神经元的外核和近端树突内（图1c）。AL 在新皮质核周的三荧光团 (RGB) 分析中发出紫色荧光（红色和蓝色组合），反映了有效的核周酸化机制（图 1d，顶部）。为了在体内模拟 AL/LY 酸化缺陷并在体内完整大脑中验证 tfLC3 探针，6 个月大的 TRGL 小鼠通过脑室内连续给予两亲性弱碱氯喹 (CQ) 或对照品 5 天，并对新皮质层 III-V 中的神经元进行成像（图 1d）。囊泡 pH 值高于 6.0 会导致 tfLC3 阳性斑点发出黄色荧光。这些斑点将被错误识别为 AP；然而，具有 CTSD 抗体和 Alexa Fluor 647（伪蓝）二抗的 IHF 将这些斑点鉴定为 CTSD 阳性，因此鉴定为 pa-AL。在三通道合并中，它们发出白色荧光（绿色、红色和蓝色荧光）（图 1d，RGB 合并底部），与正常神经元中的紫色酸化 AL 形成对比（图 1d，RGB 合并顶部）。LYs 在 CQ 后保持蓝色（图 1d）。

图1.TRGL小鼠脑中双标签自噬传感器的设计与表达

AL 酸化缺陷在 β-淀粉样蛋白沉积之前出现

      我们将 TRGL 小鼠与 Tg2576 小鼠杂交，这是一种从 10~12 个月大开始出现 β-淀粉样蛋白斑块的 AD 模型。CTSD 联合标记显示黄色 AV 完全是 CTSD 阳性，因此是 pa-AL（图 2a，下图）。新皮质中 AV 亚型的基于色相角的分配和量化显示，Tg2576/TRGL中的 pa-AL比 TRGL多四倍，成熟的 AL 显著减少（图 2b）且pa-AL 和 AL 的大小增加（图 2c）。到 12 个月时，Tg2576/TRGL 中的核周 pa-ALs 进一步增加（图 2e，f）。ATP 酶活性的测定结果与观察到的 pH 值缺陷一致，与年龄匹配的野生型（WT）同窝仔相比，6 个月大的 Tg2576 LY/AL中的 vATP 酶活性降低（图 2d）且到12 个月时在 Tg2576 小鼠脑中进一步降低（图 2g）。时程图表示随着vATP酶活性下降，pa-AL 的患病率随年龄增长而增加（图 2h）。

图2.AD 模型小鼠早期出现 AL 酸化缺陷并随着年龄的增长而进展

疾病早期APP-βCTF/Aβ 在 pa-AL 中积累

      在AD中 APP-βCTF 和 Aβ在细胞内累积发生在β-淀粉样蛋白在细胞外沉积之前，内体-溶酶体系统代表了它们产生的主要亚细胞位点。探究者将 APP-βCTF/Aβ 细胞内积累与 Tg2576 小鼠的早期 AL 酸化缺陷联系起来后的结果显示，到 5 个月时Tg2576/TRGL 小鼠中 40% 的 III-V 层新皮质外周含有 Aβ/APP-βCTF 阳性斑点（图 3a），这些几乎完全是 pa-AL（图 3a，箭头和图 3b）。而富含 LC3-II 的 AV 级分含有丰富的 APP-βCTF 以及 γ-分泌酶成分（图 3c）。此外，使用改进的 Duolink 技术进一步验证了 AVs 中的 APP-βCTF 定位（图 3d）。红色PLA 信号显示在 APPswe 过表达的 N2A 细胞和 Tg2576 神经元中检测到 APP-βCTF，其水平显著高于对照组（图 3e，箭头）。值得注意的是，蓝色PLA 信号显示在 Tg2576/TRGL 核周体内酸化不良的 AL 中，APP-βCTF选择性积累（图 3f）。

图3.神经元内 APP-βCTF/Aβ 在 AD 小鼠的 pa-AL 内选择性积累

逐渐受损的神经元大量积累 pa-AL

      在 10 个月大的 Tg2576/TRGL 小鼠中，新皮层神经元亚群（III-V 层）开始积累显著增大的 pa-AL，并使质膜向外凸出（图4a）。LC3 阳性囊泡的大量增殖伴随着从质膜突出并扩大核周周长的强荧光膜泡的形成。一个没有 LC3 荧光的中央核区（图4a) 可以通过核标记物进行标记，包括 DAPI、组蛋白 H3 或核纤层蛋白 A/C（图4b,c）。受影响的核周体中大多数 的AV是 pa-AL（图 2）。（图4d)，这反映了 AL 成熟和酸化的严重不足。他们在五种不同的 AD 小鼠模型中观察到相同的自噬神经退行性模式（图 4e）。使用该模型进一步研究 LC3 阳性膜泡的发展与疾病进展之间的关系，包括定量淀粉样斑块病理学。在这之前没有在神经退行性状态中描述过类似的充满 AV 的巨大核周膜突起。这种独特的退化过程被命名为 PANTHOS，受影响的细胞被称为 PANTHOS 神经元。

图4.tfLC3 探针揭示了不同 AD 小鼠模型中自噬应激、AL pH 不足和质膜起泡 ('PANTHOS') 的独特模式

PANTHOS——AD中一种独特的神经退行性变模式

      tfLC3 探针提供的更高分辨率的自噬分布显示直接从 PANTHOS 神经元的核周细胞质延伸的 AV 填充泡（图 5a）。电子显微镜（EM）分析证实了泡与核周细胞质的连续性，并将 AVs 确定为泡内的主成分（图 5b）。核周泡显示出从 PANTHOS 神经元的胞体延伸的结合于颈部的长膜（图 5c）。其他特征包括位于中心的电子密集网络，该网络由辐射膜结合的管状延伸部分组成，包含部分融合和完全结合的 AV 以及具有强烈 Aβ 免疫反应性的 6 纳米纤维束（图 5c，图 6d）。并且可以看到 AV 和含有 Aβ 阳性纤维的管状延伸部分正在融合的过程（图 5d）。泡中大多数 AV是ACP酶-强阳性 AL（图5e）。EM图像（图5f）证实了早期 PANTHOS 轮廓的大小接近正常神经元的大小（图5g），但随着核周起泡变得更广泛，轮廓的周长逐渐扩大（图 5h ）PANTHOS 神经元的 DAPI 阳性中心区域近似于EM 图像中电子密集的中心区域的大小（图 5g）。3D 重建模型说明核周具有广泛起泡的特征（图 5i）。

图5.AD小鼠模型中PANTHOS神经元的超微结构表征

PANTHOS 神经元是淀粉样斑块的主要来源

      在 5xFAD/TRGL 小鼠中，Aβ 和 APP-βCTF在 pa-AL 内选择性累积发生在出现 β-淀粉样蛋白斑块之前（图6a）。神经元向 PANTHOS 模式的转变伴随着核周 Aβ/APP-βCTF 免疫反应性的强烈增加。用 DAPI 和抗β-淀粉样蛋白抗体 (4G8) 共同标记这些 PANTHOS 神经元，确定了一个在最受影响的外核中心的被4G8 阳性电晕围绕着的DAPI 阳性核残留物，（图 6b）。在 5xFAD/TRGL 小鼠中，PANTHOS 神经元中心区域的定量光谱分析将 DAPI 荧光与 4G8 免疫标记引起的荧光区分开来（图 6c）。并且将这一Aβ免疫反应性的中心增加定位在神经元内膜管轮廓内（图6d）。在许多相同的轮廓中，宽度约为 10 nm的3D6 阳性原纤维束，接近已知原纤维 β-淀粉样蛋白的直径（图6d)。核周AVs 也被证明与膜管结构的中央 Aβ 阳性网络连续并结合（图6e）。由于 AD 脑中的自噬诱导维持在较高水平， 因此AP 膜成分的关键来源ER越来越多地动员起来以产生新的 AP膜。然而，随着 AV 的积累耗尽了可用膜的来源，富含 APP 的 ER 和高尔基体膜进入内体，成为 APP-βCTF/Aβ 生成的主要来源。因此，ER 和高尔基体可能是淀粉样蛋白原纤维网络扩展的关键贡献者，它们通过对膜和 β-淀粉样蛋白前体的贡献来支持 AP/AL 的形成。

图6. AD小鼠模型大脑中PANTHOS神经元中神经元内β-淀粉样蛋白增生和分布的演变

      与 PANTHOS 是淀粉样蛋白斑块的主要来源一致，5xFAD/TRGL小鼠中用 3D6 对 β-淀粉样蛋白进行免疫标记揭示了单个 PANTHOS 神经元和单个淀粉样蛋白斑块之间的独立共存与一对一的定量关系（图 7a）。所有 PANTHOS 神经元均为 3D6 阳性，在 PANTHOS 病变中可检测到大脑内约%91.7的总 3D6 信号（图 7b）。此外，在2.7 月龄的5xFAD/TRGL 小鼠皮质内 约%91.4 的 PANTHOS 病变中可检测到DAPI 阳性核信号，包括核周中心的浓缩或碎片/扩散信号（图 7c，图7d，上图）。在老年小鼠（6 个月）中67.8% 的 PANTHOS 神经元仍显示 DAPI 核信号（图7d，下图）这些结果显示绝大多数淀粉样蛋白斑块起源于相应的个体 PANTHOS 神经元。从完整的有核 PANTHOS 神经元过渡到 DAPI 消失的更晚期阶段，伴随着细胞的神经胶质入侵，这可能代表了细胞完整性的丧失与向细胞外斑块的转化。

图7. PANTHOS 神经变性与 β-淀粉样蛋白斑块形成和随后的溶酶体神经元细胞死亡相吻合(a-d)

溶酶体透化促进神经元细胞死亡

溶酶体碱化可促进溶酶体膜透化和组织蛋白酶释放到胞质中。与 WT 同窝小鼠的大脑相比，6 月龄的 5xFAD 小鼠大脑细胞质中溶酶体酶的水平显著增加（图 7e），且可检测到溶酶体酶渗漏。与调整后的正常神经元相比，PANTHOS 神经元在与 CTSD 共标记的 5xFAD/TRGL 小鼠大脑中显示出弥漫性 CTSD 免疫反应性。（图 7f）

图7. PANTHOS 神经变性与 β-淀粉样蛋白斑块形成和随后的溶酶体神经元细胞死亡相吻合(e-f)

PANTHOS 神经元在 AD 模型中进化为老年斑

为了表征 PANTHOS 神经元病变向成熟斑块的演变，研究者用硫黄素 S (Thio-S) 对 PANTHOS 进行免疫标记以检测致密的老年斑块（图8a）。对2.2 月龄的5xFAD/TRGL 小鼠进行定量分析，一半的 PANTHOS为硫代-S阳性，而在 6 月龄的 5xFAD/TRGL 小鼠中，超过 95% 为硫代-S阳性（图8a，图表）。为了进一步表征，研究者对反应性星形胶质细胞和小胶质细胞进行了免疫标记。这两种神经胶质细胞最初通常与 PANTHOS 神经元相关，因此不太可能成为 PANTHOS 发育的主要触发因素。在对 2.7月龄的5xFAD/TRGL小鼠的定量分析中，大多数 PANTHOS 神经元未与小胶质细胞或星形胶质细胞接合（图 8b）。在年龄较大的 5xFAD/TRGL 小鼠（6 个月）中，表现出结构完整性丧失的PANTHOS 神经元越多，未被小胶质细胞和星形胶质细胞接合的受影响神经元就越少（图8b）。在较老的 5xFAD 小鼠中，当相邻的 PANTHOS 神经元合并成一个更大的结构时，PANTHOS 病变经常扩展成包含多个硫代-S 阳性致密核心（图 8d）的巨大老年斑（图8c）。而在这些不断增长的病灶中，原始 PANTHOS 神经元及其相邻神经元的完整性丧失产生了持续存在的 β-淀粉样蛋白的中央核心，这些中央核心同样不断扩大，最终产生扩大的细胞外致密老年斑（图 8b）。

图8. PANTHOS 神经元在 AD 模型中演变为经典的致密老年斑

研究者们利用双荧光探针识别了自噬区室及其体内 pH 值的相关变化，并且发现了一种PANTHOS这一全新的极端自噬应激模式，其特征是含有 APP-βCTF/Aβ 且酸化较差的 AV 在核周体大量积累。这一研究结果提供了更多的证据显示溶酶体酸化和 vATP 酶复合物失调是与神经退行性疾病相关的遗传与代谢紊乱的常见目标。同时强烈支持了AD中 APP 代谢物与LY 功能障碍间的致病联系。通过靶向溶酶体 pH 不足能显著缓解这种基于APP 的 AD 模型存在的PANTHOS 级联反应。

这个颠覆性的研究为阿尔兹海默症的治疗带来新方向，希望可以借此推动AD药物研发从而为患者带来福音！

参考文献

Lee JH, Yang DS, et al. Faulty autolysosome acidification in Alzheimer's disease mouse models induces autophagic build-up of Aβ in neurons, yielding senile plaques. Nat Neurosci. 2022 Jun;25(6):688-701.