Phos-tag Biotin BTL-104
目录号 : GK10006Phos-tag Biotin BTL-104是一种单生物素化的 Phos-tag衍生物，包含ZnCl2，可用于检测磷酸肽和纯化的磷酸化蛋白。Phos-tag是一种能与磷酸离子特异性结合的功能分子。
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1、Phos-tag Biotin BTL-104试剂的准备：
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Sol. A: 三氮唑缓冲盐水 |
三氮唑缓冲盐水 (10xTBS, 1 L, pH 7.5) Tris (0.10 mol/L) -----------------------------------------------12.1 g NaCl (1.0 mol/L) -----------------------------------------------58.4 g 蒸馏水----------------------------------------------------------0.9 L 用于将pH调整至7.5的2 mol/L盐酸--------------------------适量 用于配制1升溶液的蒸馏水-------------------------------------适量 |
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Sol. B: Tween 20 溶液 |
10% (v/v) Tween 20 溶液 (50 mL) Tween 20 ----------------------------------------------------------5 mL 蒸馏水---------------------------------------------------45 mL |
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Sol. C: TBS-T |
1xTBS-T (1 L) 溶液 A ----------------------------------------------------------100 mL 溶液B -----------------------------------------------------------10 mL 蒸馏水------------------------------------------------890 mL |
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Sol. D: Phos-tag Biotin BTL-104 甲醇溶液 |
Phos-tag Biotin BTL-104甲醇溶液 Phos-tag Biotin BTL-104 (MW: 767)--------------------------10 mg 甲醇-----------------------------------------------0.13 mL 【储存】在4℃的黑暗处储存。 |
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Sol. E: Phos-tag Biotin BTL-104 溶液 |
Phos-tag Biotin BTL-104 溶液 (10 mmol/L) 溶液 D-------------------------------------------------------0.13 mL 溶液 C-------------------------------------------------------1.17 mL 【储存】在4℃的黑暗处储存。 |
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Sol. F:氯化锌水溶液
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10 mmol/L氯化锌水溶液 (50 mL) ZnCl2 (FW. 136.3)---------------------------------- 68.15m g 蒸馏水--------------------------------------------------50 mL |
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Sol. G: HRP-偶联链霉亲和素溶液 |
HRP-偶联链霉亲和素
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2、Phos-tag Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素溶液的制备：
1) 混合以下溶液，得到的溶液（溶液H）在室温静置30min。
溶液C (1xTBS-T) ------------------------------------------------------ 469μL
溶液E (Phos-tag Biotin BTL-104溶液) * -------------------------- 1 ~ 10μL
溶液F (10 mmol/L ZnCl2) --------------------------------------------- 2 ~ 20μL
溶液G (HRP-偶联链霉亲和素) ------------------------------------- 1μL
2) 将溶液H加入离心过滤器杯（NMWL = 30,000，NanosepTM 30K）。使用附带的盖子密封。
3) 室温下离心（14,000 x g）20min，去除多余的Phos-tag Biotin。
4) 杯中剩余的溶液（<10μL）用30 mL的溶液C (1xTBS-T) 进行稀释，得到溶液Phos-tag Biotin-SH（Zn2+- Phos-tag Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素的溶液）。
注：
* [ Phos-tag Biotin BTL-104] >> [HRP-偶联链霉亲和素]
溶液Phos-tag Biotin-SH中的Phos-tag Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素在4℃条件下稳定保存30天。
3、Phos-tag Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素蛋白印迹实验步骤：
1) 在保鲜盒中用溶液C (1xTBS-T)浸泡一块蛋白质印迹的聚偏氟乙烯膜（PVDF膜），请戴上橡胶手套。低速震荡膜至少1h，确保膜不会附着在保鲜盒上。注意不要让膜变干。
2) 使用溶液 Phos-tag Biotin-SH（每5 cm2约1 mL）在一个塑料袋中孵育膜，低速震荡袋子30min。
3) 从袋中取出膜，用溶液C（每5 cm2约10 mL）在保鲜盒中洗涤2次，每次室温下低速震荡5min。确认膜不会附着在保鲜盒上，注意不要让膜变干。
4) 使用适量的化学发光试剂（例如，Ultra High Sensitivity ECL Kit GK10008），观察化学发光信号，可以使用X光胶片或图像分析仪。
4、重新探测蛋白质印迹的PVDF膜的步骤如下：
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Sol. K: Tris-HCl 缓冲液 |
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(1 L, pH 6.8) Tris ----------------------------------------------------------- 60.6 g 蒸馏水--------------------------------------------------0.8 L 6 mol/L盐酸（用于调整pH至6.8）------------------------ 适量 用于配制1升溶液的蒸馏水-------------------------------------适量 |
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Sol. L: SDS 溶液 |
10% (w/v) aqueous SDS溶液(1 L) SDS ----------------------------------------------------------100 g 用于配制1升溶液的蒸馏水-------------------------------------适量 |
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Sol. M: 去离子缓冲液 |
去离子缓冲液(1 L) 溶液K --------------------------------------------------------125 mL 溶液L -------------------------------------------------------200 mL 2-巯基乙醇----------------------------------------- 7 mL 蒸馏水---------------------------------------------668 mL |
1) 被Zn2+-Phos-tag Biotin和HRP-偶联链霉亲和素探测的蛋白质印迹的PVDF膜在保鲜盒中加入溶液C (1xTBS-T, 25 mL/5 cm2) 浸没。低速震荡膜至少1h。注意不要让膜变干。如果膜变干，可以在此去离子处理前用甲醇浸泡膜。
2) 在保鲜盒中加入溶液M (1xTBS-T, 25 mL/5 cm2) 浸没膜，室温低速震荡20min。确认膜不会附着在保鲜盒上。
3) 在保鲜盒中加入溶液C(1xTBS-T, 25 mL/5 cm2) 浸没膜，室温低速震荡1h，洗3次。确认膜不会附着在保鲜盒上，注意不要让膜变干。
4) 采用适当的蛋白质进行膜封闭，然后采用适当的抗体重新探测。进行化学发光分析。
5、故障排除
1) 溶液E中的 Phos-tag Biotin (10μL) 与溶液G中的 Streptavidin-conjugated Horseradish Peroxidase (1μL) 相比是大量过量的。我们使用更少的Phos-tag Biotin（例如，1μL溶液E）和相同量的溶液G（1μL）得到了几乎相同的结果。用户应该调整溶液D 的体积以获得所需的灵敏度或节省费用。如果减少溶液E 的体积，则无需改变锌(II) 溶液（溶液F）的体积。
2) 如果膜未充分浸泡在溶液C 中，则背景信号会高且斑点状。此外，可能观察不到蛋白质信号。确认膜不会排斥溶液C。
3) 强烈推荐使用 PVDF 膜进行Phos-tag Biotin方法。
【注意】：上述内容提供了针对使用 Phos-tag Biotin方法的可能问题的解决方案。用户在进行实验时应仔细检查并根据实际情况调整实验条件。
6、常见问题解答
1) 灵敏度水平如何？
答：在纳克级别。使用高发光试剂，如 ImmunoStar LD。
2) 除了此产品，我们是否需要其他试剂？
答：需要准备HRP-偶联链霉亲和素溶液。
3) Phos-tag Biotin BTL-104可以使用多少次？
答：取决于使用频率。请参考以下作为指南。BTL-104：130～1300 次
4) 磷酸化的蛋白质可以进行检测吗？
答：可以进行基于条带密度的半定量检测。
5) 是否可以确定结合的磷酸基团的数量？
答：不可以。
6) 我能否去掉Phos-tag Biotin BTL-104的抗体？
答：是的，可以。将其与含有62.5 mM Tris-HCl（pH 6.8）、2% (w/v) SDS 和 0.1 M 2-巯基乙醇的溶液混合，并摇动混合物15min。然后，用1xTBS-T洗3次每次10min冲洗混合物。
7) 推荐使用哪种膜？
答：我们推荐使用 PVDF 膜。
8) 使用Phos-tag Biotin BTL-104是否需要封闭？
答：不需要。封闭会导致灵敏度下降。
Phos-tag is a new type of phosphate-binding tag and functional molecule that can specifically bind phosphate ions under neutral pH (physiological pH) conditions. Phos-tag is a bicyclic metal complex (1,3-bis[bis(pyridin-2-ylmethyl) amino]propan-2-olato dizinc(II) complex), which is a selective phosphate binding tag in In an aqueous solution with a neutral pH, in the case of Zn2+, its Kd value for phenylphosphate dianion (PH-OPO32-) is 25 nM. Therefore, various methods for phosphoproteomic studies using Phos-tag derivatives were developed. Here, we introduce a new application of Phos-tag, which is the chemiluminescence detection of all phosphorylated proteins on electroblotted PVDF membranes using biotinylated Phos-tag zinc(II) complex.
Phos-tag Biotin provides a sensitive method for detecting phosphorylated proteins on PVDF membranes that requires streptomycin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) and chemiluminescent detection reagents.
Phos-tag是一种新型的磷酸盐结合标签和功能分子，在中性pH（生理pH）条件下可以特异性结合磷酸离子。Phos-tag是一种双环金属络合物（1,3-bis[bis(pyridin-2-ylmethyl) amino]propan-2-olato dizinc(II) complex），是一种选择性的磷酸结合标签，在中性pH的水溶液中，在存在Zn2+的情况下其对苯基磷酸酯二价阴离子（PH-OPO32-）的Kd 值为25 nM。因此，用Phos-tag衍生物进行磷酸化蛋白质组研究的各种方法被开发出来。这里，我们引入了Phos-tag 的一种新应用，即用生物素化Phos-tag 锌(II) 复合物对电印迹PVDF膜上的全部磷酸化蛋白进行化学发光检测。
Phos-tag Biotin BTL-104提供了一种检测PVDF膜上磷酸化蛋白的敏感方法，该方法需要链霉素偶联辣根过氧化物酶（HRP）和化学发光检测试剂。
References:
[1] Fanqiang Meng, Fengxia Lu, et al. "Acetate and auto‐inducing peptide are independent triggers of quorum sensing inLactobacillus plantarum." Mol Microbiol. 2021 Jul;116(1):298-310. PMID: 33660340
[2] Haijing Guo, Jen-Hsuan Wei, et al. "TPX2 activation by GM130 controls astral microtubule formation and spindle orientation." bioRxiv. March 17, 2020.
| Components | Formula | M.Wt | Solubility |
| Phos-tag Biotin BTL-104 | C40H50N10O4S | 766.95 | DMSO: >32.3 mg/mL |
| ZnCl2 | ZnCl2 | 197.90 | Water: >1 g/mL |
| 应用&特点 | ● 无辐射。
● 无需PVDF膜的封闭处理。 ● Phos-tag™ 的特异性结合与氨基酸种类、序列无关。 ● 可适用于免疫印迹和质谱分析等后续工作。 ● Phos-tag™ BTL母液可稳定保存至少6个月。 ● 实验流程与使用HRP标记抗体相类似。 |
| 运输方式 | 蓝冰运输或根据您的需求运输。 |
| 储存条件 | 2-8℃，可稳定长达12个月。 |
| 用途 | 仅供研究使用!不能用于人体。 |