Ni-NTA His-Tag Purification Agarose

1. Buffer 的准备

请根据不同的样品选择合适的 Buffer，也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系，基本原则是“低咪唑上样，高咪唑洗脱”，或者“ 高 pH 上样，低 pH 洗脱”。Buffer 在使用前用 0.22 μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌。Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 可以用于可溶蛋白和包涵体蛋白  的纯化，两者所需 Buffer 不同，具体配置方法见下表：

可溶性 His 标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

包涵体 His 标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

2. 样品处理：

细菌或酵母表达的蛋白

(1) 挑取单菌落到培养基，根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

(2) 表达结束后，收集菌液至离心管中，7000 rpm，离心 15 分钟，弃上清，收集菌体沉淀。随后加入 1/10 体积的 Lysis Buffer 和蛋白酶抑制剂。加入溶菌酶 (工作液浓度为 0.2-0.4 mg/mL；如果表达的宿主细胞内含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶)，需确认加入的蛋白酶抑制剂不会影响目的蛋白与 Agarose的结合。

(3) 将菌体沉淀重悬混匀 (如果菌液浓度高，也可选择加入 10 μg/mL RNase A 和 5 μg/mL DNase I)，放置在冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

(4) 将澄清的破碎液转移至离心管中，10000 rpm，4℃ 离心 20-30 分钟。取上清，置于冰上备用或 -20℃ 保存。

酵母、昆虫和哺乳动物分泌表达可溶性蛋白

(1) 将细胞培养液收集至离心管中，5000 rpm，离心 10 分钟，取上清，弃沉淀，如上清中不含 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，可直接加入柱子进行后续操作；如含有 EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用 1×PBS 在 4℃ 条件下经透析后才能加入柱子。

(2) 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，用 1×PBS 在 4℃ 条件下经透析后才能加入柱子。

包涵体蛋白 (变性条件)

(1) 将培养液收集至离心管中，7000 rpm，离心 15 分钟，弃上清，收集菌体沉淀。

(2) 按照菌体: Lysis Buffer=1:10 (W/V) 的比例将菌体重悬混匀，冰浴超声破碎。

(3) 将破碎液转移至离心管中，10000 rpm，4℃ 离心 20-30 分钟。弃上清，重复步骤 (2) 和步骤 (3) 一次。

(4) 按照菌体: Lysis Buffer (含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例将包涵体悬浮起来。

(5) 变性条件下进行His标签重组蛋白纯化操作。

3. Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 的装填：

(1) 用去离子水冲洗柱底筛板，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出 1-2 cm 的去离子水。

(2) 将 Agarose 悬浮混匀，小心地将浆液连续地倒入柱管中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

(3) 打开柱底部出口，最初让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，得到很好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上 3 倍柱体积的去离子水。标记柱床高度。

(4) 关闭柱底部出口。

4. 样品纯化：

(1) 平衡：使用至少 5 倍柱体积的 Lysis Buffer 平衡层析柱。

(2) 上样：利用泵或注射器上样。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或使用滤膜 (0.22 μm 或 0.45 μm)过滤。

(3) 洗杂：用 Wash Buffer 冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线 (一般至少 10-15 倍柱体积)，收集流出组分和洗杂部分。

注：在平衡缓冲液加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。

(4) 洗脱：用 Elution Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常 5 倍柱体积洗脱液就足够了；线性梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如 20 倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。

(5) SDS-PAGE 检测：将纯化得到的样品 (包括流出组分、洗杂部分和洗脱部分)以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。

5. 在位清洗 (Cleaning-in Place, CIP)：

(1) 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类：使用 5-10 倍柱体积的 30% 异丙醇清洗，接触时间为 15-20 分钟可以去除此类污染物，然后再使用 10 倍柱体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液清洗 2 倍柱体积。去污剂处理后，需要使用 5 倍柱体积的70% 乙醇清洗，以彻底去除去污剂。最后使用 10 倍柱体积的去离子水清洗。

(2) 去除离子作用结合的蛋白：使用 1.5 M NaCl 溶液清洗，接触时间为 10-15 分钟，然后再使用 10 倍柱体积的去离子水清洗。

6. 填料再生：
当 His 标签重组蛋白纯化填料使用过程中发现颜色变浅，或者填料载量明显变低时，需要对填料进行镍离子剥离和镍离子重挂，也就是填料再生。将填料装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行镍离子剥离和镍离子重挂。

(1) 加入 2倍柱体积的 0.2 M 醋酸溶液 (含 6 M GuHCl ) 清洗一次。

(2) 加入 5倍柱体积的去离子水清洗一次。

(3) 加入 3倍柱体积的 2% SDS清洗一次。

(4) 加入 5倍柱体积的去离子水清洗一次。

(5) 加入 5倍柱体积的无水乙醇清洗一次。

(6) 加入 5倍柱体积的去离子水清洗一次。

(7) 加入 5倍柱体积的 100 mM EDTA (pH 8.0) 清洗一次。

(8) 加入 5倍柱体积的去离子水清洗一次。

(9) 加入 5 倍柱体积的 100 mM NiSO₄清洗一次。

(10) 加入 10 倍柱体积的去离子水清洗一次。

(11) 填料再生后，可以立即使用，也可以保存在 20% 的乙醇中，置于 4℃ 保存。