MitoTracker Orange CMTMRos
目录号 : GC71774MitoTracker Orange CMTMRos 是一种线粒体特异性荧光染料探针（激发/发射：561nm / 580–620nm），可以穿透细胞膜，常用于标记和成像活细胞中的线粒体。
Cas No.:199116-50-2
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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MitoTracker Orange CMTMRos is a mitochondrial-specific fluorescent dye probe (excitation/emission: 561nm / 580–620nm) that can penetrate the cell membrane and is commonly used for labeling and imaging mitochondria in living cells [1]. MitoTracker Orange CMTMRos relies on mitochondrial membrane potential for localization and can stably bind to proteins in the inner mitochondrial membrane, thereby being used to assess the number, morphology, and functional status of mitochondria [2-3].
References:
[1]. Chazotte B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 Aug 1; 2011(8): pdb-rot5648.
[2]. Nikiforov NG, Ryabova A, Kubekina MV, et al. Two Subpopulations of Human Monocytes That Differ by Mitochondrial Membrane Potential. Biomedicines. 2021 Feb 4; 9(2): 153.
[3]. Nikiforov N, Ryabova A, Kubekina M, et al. Two sub-populations of human monocytes differing in mitochondrial membrane potential. Atherosclerosis. 2021 Aug 1; 331: e69.
MitoTracker Orange CMTMRos 是一种线粒体特异性荧光染料探针（激发/发射：561nm / 580–620nm），可以穿透细胞膜，常用于标记和成像活细胞中的线粒体 [1]。MitoTracker Orange CMTMRos 依赖于线粒体膜电位进行定位，并能稳定地结合线粒体内膜上的蛋白质，从而用于评估线粒体的数量、形态和功能状态 [2-3]。
本方案描述了使用MitoTracker Orange CMTMRos对人单核细胞中的线粒体膜电位（MMP）进行活细胞成像的方法。实际情况可能需要针对细胞类型、染料浓度和成像设置进行优化 [1-2]。
1. 试剂和材料准备
MitoTracker Orange CMTMRos，无血清细胞培养基，羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP；5µM溶于DMSO）用于阴性对照，磷酸盐缓冲液（PBS），预冷至4℃。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA；100mg/L溶于培养基），原代人CD14+单核细胞。
2. 实验步骤
（1）细胞制备与接种
使用密度梯度离心和磁珠分离法从外周血中分离CD14+单核细胞。将细胞以1×106个/mL的密度接种于24孔板的盖玻片上，加入无血清X-Vivo 10培养基。37℃、5% CO2孵育2-6小时，使细胞贴壁。使用台盼蓝染色验证细胞活力（>98%）。
（2）线粒体染色
在预热的无血清培养基中配制100nM MitoTracker Orange CMTMRos。避光保存；使用前立即稀释原液（1mM，溶于DMSO）。用染料溶液（500µL/孔）替换培养基。37℃、5% CO2孵育细胞20分钟。用温PBS洗涤两次，以去除多余的染料。
（3）阴性对照（MMP消融）
在37℃、5% CO2条件下，用5µM FCCP在培养基中处理平行孔30分钟。按照步骤(2)使用MitoTracker Orange CMTMRos染色。由于基质金属蛋白酶（MMP）耗散导致荧光信号丢失。
(4) 显微镜检查和图像采集
使用共聚焦显微镜观察细胞：激发波长：561nm激光。发射波长：580-620nm滤光片。
包含透射光通道用于形态学观察。使用Tile Scan模式采集≥27张/例图像（225 × 225µm² 图像）。
（5）图像分析
使用机器学习软件处理图像：将像素分类为“目标”（细胞）或“背景”。区分单峰（完整细胞）与团块/碎片。量化每个细胞的荧光强度。使用核密度图（双峰分布；以极值作为阈值）定义“MitoTracker Orange CMTMRos-low”细胞。
注意事项
（1）染料优化：针对新细胞类型测试 50-200nM 染料浓度。避免固定；MitoTracker 需要活细胞才能准确检测 MMP。
（2）时间敏感性：限制染色后延迟时间（<30分钟），以防止光漂白。
（3）对照：始终包含经FCCP处理的细胞（无MMP）和未染色的细胞（自发荧光对照）。在低MMP细胞中，通过5-ALA → PpIX的转化来验证线粒体功能。
（4）细胞健康：无血清条件可降低背景，但可能会使细胞应激；孵育时间应限制在6小时以内。
（5）成像参数：使用经FCCP处理的细胞校准激光功率，以避免饱和。在各个实验中使用相同的设置进行定量比较。
（6）数据标准化：如果跨样本比较，则根据细胞大小或蛋白质含量对荧光进行标准化。
（7）储存：立即分析图像或将原始数据储存在-80℃；避免反复冻融。
References:
[1]. Nikiforov NG, Ryabova A, Kubekina MV, et al. Two Subpopulations of Human Monocytes That Differ by Mitochondrial Membrane Potential. Biomedicines. 2021 Feb 4; 9(2): 153.
[2]. Nikiforov N, Ryabova A, Kubekina M, et al. Two sub-populations of human monocytes differing in mitochondrial membrane potential. Atherosclerosis. 2021 Aug 1; 331: e69.
| Cas No. | 199116-50-2 | SDF | |
| 分子式 | C24H24Cl2N2O | 分子量 | 427.37 |
| 溶解度 | DMSO : 31.25 mg/mL (73.12 mM; ultrasonic and warming and heat to 60°C; Hygroscopic DMSO has a significant impact on the solubility of product, please use newly opened DMSO) | 储存条件 | Store at -20°C, sealed storage, away from moisture and light |
| General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限：-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度，请将管子加热至37℃，然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
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| Shipping Condition | 评估样品解决方案：配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸：配备RT，或根据请求配备蓝冰。 | ||
| 制备储备液 | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 2.3399 mL | 11.6995 mL | 23.3989 mL |
| 5 mM | 0.468 mL | 2.3399 mL | 4.6798 mL |
| 10 mM | 0.234 mL | 1.1699 mL | 2.3399 mL |
| 第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量） | ||||||||||
| 给药剂量 | mg/kg |  |
动物平均体重 | g | |
每只动物给药体积 | ul | |
动物数量 | 只 |
| 第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方） | ||||||||||
| % DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
| 计算重置 | ||||||||||
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL saline，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。
Quality Control & SDS
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