MitoSOX Green

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

1、制备染色液

（1）染料储存液：将冷冻保存的产品室温放置融化，经短暂离心将粉末集中在底部。本产品每管9μg，添加10μL无水DMF（不能使用DMSO或其他溶剂）溶解，配置浓度为1mM的储存液。

注意：配置好的储存液能够稳定一天，建议现用现配。

（2）染料工作液：将配置好的储备液加入缓冲液（含钙和镁的HBSS或其他类型缓冲液，下同）中，配置浓度为0.5-5µM的染料工作液。

2、设置对照组（选做）

（1）阳性对照组-诱导超氧化物歧化酶：在低葡萄糖培养基添加30μM的MitoPQ(GC44204)，孵育细胞18小时；

（2）阴性对照组-抑制超氧化物的形成：使用含2mg/mL的DETA NONOate（GLPBIO，GC18259）或Spermine NONOate（GLPBIO，GC13694）的HBSS缓冲液（含钙和镁，新鲜制备）处理细胞1分钟，而后在37℃和5% CO₂的条件下孵育细胞30分钟。

3、细胞悬浮染色(以6孔板为例)

（1）悬浮细胞经1000g离心3-5min。弃去上清液，使用缓冲液清洗两次，每次5分钟。

（2）贴壁细胞使用PBS清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min。

（3）加入1mL染料工作液重悬细胞，在条件为37℃和5% CO₂的培养箱中避光孵育30min分钟。

注意：不同细胞最佳孵育时间不同，建议根据实际情况进行调整。

（4）孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，使用预温的缓冲液清洗2-3次。

4、细胞贴壁染色

（1）在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。

（2）从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。

（3）从盖玻片的一角加入约100μL染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞，室温避光孵育5-30min分钟。

（4）吸弃染料工作液，使用预温的缓冲液清洗盖玻片2~3次。

5、显微镜检测：MitoSOX Green的最大激发光/发射光波长为488/510nm。

注意事项：

（1）建议在染色2h内进行观察。

（2）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

（3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。