Calcium Orange AM

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1.制备染色液
(1)配置储存液: 在高质量无水DMSO中制备浓度为1-10mM的AM酯储存液；
注意:
①未使用的储存液分装后在-20℃或-80°C避光保存，避免反复冻融；
②乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如:无血清和酚红的培养基或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-10μM的工作液。
注意:
①AM酯染色工作液制备时，有时需要往储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性；
②Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但PluronicF-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存；
③配制20%(w/v) Pluronic F-127母液:称取100mg Pluronic F-127粉末(货号: GB30090)，加入500μl DMSO，40-50℃加热20-30min，室温保存。如有结晶析出可重新加热溶解，不影响使用；
④（可选）GLPBIO提供溶解好的Pluronic F-127(20% Solution in DMSO) ，货号：GB30091；
⑤添加等体积20% Pluronic F-127溶液到储存液中，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%；
⑥请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配，避免反复冻融。

2.细胞悬浮染色
(1)悬浮细胞：经4°C、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，使用PBS或其他缓冲液清洗两次，每次5分钟；
(2)贴壁细胞：使用PBS或其他缓冲液清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min；
(3)加入染料工作溶液重悬细胞，室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
注：
AM酯类染料在大部分细胞中的推荐工作浓度为4-5μM，具体使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有①效结果的基础上尽量使用最低探针浓度；
②（可选）如果细胞内含有机阴离子转运体，可能需要在细胞培养基中加入丙磺舒(GC16825，Probenecid，1-2.5mM)或磺吡酮(GC11049 ，Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM)，以降低去酯化 探针的泄露水平。丙磺舒或磺吡酮储存液偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH；
③若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低染料加载效果；而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次；
④降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除染色液，加入PBS或其他缓冲液清洗2-3次，去除残留探针；
(5)室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

3.细胞贴壁染色
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞；
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中；
(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞；
(4) 室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用PBS或其他缓冲液清洗盖玻片2~3次；
(6)室温孵育30min。

4.显微镜检测：Calcium Orange AM的最大激发波长和发射波长分别为549/576nm。

注意事项：
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
References:
[1]. Inami W, et al. Intracellular calcium ion concentration measurement using a phase-modulation fluorescence lifetime method with compensation for phase shift due to the presence of proteins. Anal Sci. 2013;29(2):199-203.