Tyramide Signal Amplification Kit (Tyramide-647)

使用说明：
1.自备试剂。
a.洗涤液：PBS或免疫染色洗涤液。通常免疫染色洗涤液比PBS有更好的洗涤效果，能更好地降低染色背景。
b.固定和通透试剂：4%多聚甲醛固定液或免疫染色固定液；免疫染色通透液(Triton X-100) 或免疫染色强力通透液。
c.抗原修复液：柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X)、柠檬酸钠抗原修复液(50X) 、改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X) 等。
d.内源性过氧化物酶封闭试剂：内源性过氧化物酶封闭液或3%过氧化氢溶液。
e.抗原封闭试剂：免疫染色封闭液或BSA、血清等。
f.所需一抗及相关二抗，推荐适用于免疫组化的高品质系列抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)等。
g.0.3%过氧化氢溶液。可以使用实验室比较常见的30%过氧化氢溶液，用水配制成0.3%过氧化氢溶液。
2.样品处理。
a.对于石蜡切片。
(a)脱蜡入水：二甲苯中脱蜡5-10分钟，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。推荐使用环保脱蜡剂(二甲苯替代品) 替代二甲苯进行脱蜡。无水乙醇5分钟，90%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
(b)抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸钠抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。具体步骤可参考相应说明书的使用说明。
b.对于冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片。
根据实验需求选择合适的固定方法，4%多聚甲醛固定液或免疫染色固定液室温固定样品15分钟。洗涤液洗涤3遍，每次5分钟。使用0.1% Triton X-100、免疫染色通透液(Triton X-100) 或免疫染色强力通透液室温通透样品5分钟。通透完毕后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
c.对于多孔板中培养的细胞。
参考上述细胞爬片的处理方式进行固定、洗涤、通透和洗涤。
注：本步骤及后续的所有孵育和洗涤都建议在翘板摇床上进行。
3.内源性过氧化物酶的封闭。如下以石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片或者细胞涂片为例进行说明，对于多孔板中培养的细胞需要适当调整液体用量，并且个别步骤也须适当酌情调整。
对于组织切片或一些其它样品，内源性过氧化物酶会导致一定程度的背景信号。使用免疫组化笔圈出组织，使用内源性过氧化物酶封闭液或3%过氧化氢溶液对样品进行灭活处理，通常室温与样品孵育10-15分钟即可。免疫组化笔推荐的Liquid Blocker Super PAP Pen (免疫组化笔)。
4.背景封闭。
使用免疫染色封闭液、含BSA或血清的自制适当封闭液室温孵育样品60分钟，或使用免疫染色封闭液室温孵育样品10分钟。
5.一抗孵育。
使用上述封闭液、免疫染色一抗稀释液免疫染色一抗稀释液，参考一抗的使用说明稀释一抗到合适的浓度。使用稀释后的一抗在载玻片染色盒或其它湿盒中室温与样品孵育1-2小时，或4ºC孵育过夜。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此一抗使用浓度需适当降低，通常可在正常IHC使用的稀释比例的基础上再稀释2-10倍，以减少非特异性结合引起的背景荧光。对于特定一抗，初次检测时建议设置一抗不同稀释比例进行优化。

6.二抗孵育。
使用免疫染色(非荧光)二抗稀释液免疫组化染色二抗稀释液或适当的自制二抗稀释液，稀释一抗所对应种属的二抗至适当的浓度。使用稀释后的二抗室温与样品孵育30-60分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。
注1：确保每轮孵育使用的二抗匹配对应一抗的种属来源。推荐辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) 、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)等二抗。
注2：TSA技术有更高的灵敏度和更强的信号，因此需要优化二抗使用浓度，可在正常免疫染色使用的稀释比例的基础上再进行进一步的稀释，以减少非特异性结合引起的背景荧光。对于特定二抗，初次检测时建议设置二抗不同稀释比例进行优化。
7.TSA染色工作液配制。
按照每个样品需50μl TSA染色工作液(TSA Staining Solution)，参考下表配制所需TSA染色工作液的总体积。配制好的TSA染色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

8.TSA标记。
TSA染色工作液室温与样品避光孵育10分钟。孵育结束后，洗涤液洗涤样品3次，每次5分钟。

9.染色效果观察。
反应完成后可在荧光显微镜下确认染色效果，注意用洗涤液覆盖样品，防止干片。
10.DAPI染色细胞核。
滴加DAPI染色液，覆盖住样品即可，避光室温孵育3-5分钟。去除DAPI染色液，洗涤液洗涤3次，每次5分钟。
11.自发荧光淬灭。
a.吸除洗涤液，用蒸馏水短暂冲洗组织切片。
b.每个切片滴加50μl组织自发荧光淬灭剂。可根据组织切片的大小自行适当调整使用量，但必需完全覆盖整个组织切片。
注：请注意核对首次使用前是否已经按照包装上的指示添加了相应量的无水乙醇并混匀，同时在瓶上做好标记。如果需要更多的组织自发荧光淬灭剂，可以另行订购组织自发荧光淬灭剂。
c.室温孵育5分钟。
注：对特定类型的组织样品通常必须优化孵育时间，以最大限度地淬灭自发荧光，而不明显影响特异性的免疫荧光。进行优化时，可取数个组织切片，在免疫荧光染色完毕之后加入本产品，孵育1、3、5、10、20、40、60分钟等不同时间(首次建议尝试孵育3、5和10分钟)，最终观察荧光成像效果。如果组织自发荧光仍然很强，可进一步延长孵育时间；如果孵育时间小于10分钟而特异性的免疫荧光下降十分明显，可将孵育时间减少为1-3分钟。
d.吸除组织自发荧光淬灭剂，用蒸馏水短暂冲洗。
12.封片。
吸除切片上溶液，用抗荧光淬灭封片液封片。如需更多的抗荧光淬灭封片液，可以另行订购抗荧光淬灭封片液。
13.镜检拍照。
使用荧光显微镜、共聚焦或多光谱成像系统在相应的荧光通道下观察并采集图像。