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Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit (细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒) mysy

目录号 : GK10028

细胞核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒可用于快速、高质量提取细胞或组织的细胞质蛋白和细胞核蛋白。

Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit (细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒) Chemical Structure

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50T
¥500.00
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100T
¥850.00
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Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.

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实验参考方法

1. 准备溶液:
试剂盒中的四种试剂室温复温,溶解后立即混匀置于冰上。取适当量的细胞质蛋白抽提试剂A备用,在使用前数分钟内加入PMSF,现配现用,使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂C备用,在使用前数分钟内加入PMSF,现配现用,使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 贴壁细胞:
用PBS洗一遍,用细胞刮刀收集细胞,或用EDTA溶液处理细胞使细胞松散,并用移液器将细胞吹打下来。离心收集细胞,弃尽上清。
尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

3. 悬浮细胞:
用PBS清洗细胞,离心收集细胞,离心收集细胞,弃尽上清。

4. 每20μL细胞沉淀加入200μL添加了PMSF的细胞质蛋白抽提试剂A。(对于2*106个HeLa细胞,其细胞沉淀的体积大约为20μL或40mg。)

5. 剧烈涡旋5-10秒,避免有细胞团块。

6. 冰浴10-15分钟。

7. 加入细胞质蛋白抽提试剂B 10μL。剧烈涡旋5秒,冰浴1分钟。

8. 剧烈涡旋 5秒,4℃ 12,000g离心5分钟。

9. 立即将上清转移至新的EP管中,即得到细胞质蛋白。如无需立即使用,可以-70℃冻存。(千万不要触碰沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。每2*106个细胞用200μL细胞质蛋白抽提试剂A裂解后的上清中,其细胞质蛋白浓度约为2-5mg/ml,不同细胞有所不同。)

10. 管内的细胞核沉淀需要完全吸尽残余的上清,加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂C。(如果没有吸尽上清会带来细胞质蛋白的污染。)

11. 剧烈涡旋 15-30秒,充分混匀沉淀。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再剧烈涡旋 15-30秒,共30分钟。

12. 12,000g,4℃,离心10分钟。

13. 立即将上清转移至新的预冷EP管中,即得到细胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃冻存。每2*106个细胞用50μL本产品中的细胞核蛋白抽提试剂C裂解后获得的上清,其细胞核蛋白浓度约为1.2-3.0mg/ml,不同细胞有所不同。

14. 对于新鲜组织:
a. 将组织样品剪成尽可能小的块状。按照20:1的比例混合适当量的细胞质蛋白抽提试剂A和B(例如200μL细胞质蛋白抽提试剂A中加入10μL细胞质蛋白抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200μL组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液(对于不超过30mg的组织样品,仅需加入100μL组织匀浆液),并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。
b. 匀浆后把匀浆液转移到EP管内,冰浴静置15分钟。
c. 4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至新的预冷EP管中,为抽提得到的部分细胞质蛋白。(千万不要触碰沉淀)
d. 得到的沉淀中很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作,即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作,按照步骤4至步骤13抽提得到细胞质蛋白和细胞核蛋白。
特别说明:对于起始量为30-60mg的组织样品,后续直接按照步骤4-13操作即可;对于起始量不超过30mg的组织样品,后续步骤4-13中的溶液的用量须减半使用。
抽提得到的细胞质蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞质蛋白合并。新鲜的肝脏组织裂解后得到的蛋白溶液,其细胞质蛋白浓度约为3-10mg/ml,细胞核蛋白浓度约为3-10mg/ml,不同状态的不同组织有所不同。

15.注意事项:
a. PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入,以免PMSF在水溶液中很快失效。
b. 抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
c. 本试剂盒对于组织样品,仅适合于新鲜组织,对冻存过的组织抽提效果很差。
d. 使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。

产品描述

细胞核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)是分子生物学常用的细胞或者组织中分别提取细胞核和细胞质蛋白的试剂盒。分离提取过程大约90分钟,得到的蛋白产物可以用于研究蛋白质在细胞内的定位和分布,分离出来的核蛋白还可以用于转录调控方面的研究,还可以用于后续Western blot,EMSA,footprinting,报告基因检测以及酶活力测定等实验。
该产品是通过细胞质蛋白抽提试剂A和B,在低渗透压环境下,细胞吸水胀破,细胞膜被破坏,细胞浆蛋白释放,细胞核可通过离心沉淀收集,从而将细胞质蛋白和细胞核蛋白进行分离。继而使用细胞核蛋白抽提试剂C,即高盐缓冲液使得核结合蛋白(如转录因子)溶解,从细胞核上分离。
对于细胞样品,如果每个样品的数量不超过2*106个细胞,本试剂盒可以抽提50个样品;对于组织样品,如果每个样品的重量不超过30mg,本试剂盒可以抽提50个样品,如果每个样品约为30-60mg,本试剂盒可以抽提37个样品。

产品组成

Components 50 tests
细胞质蛋白抽提试剂A 15ml
细胞质蛋白抽提试剂B 0.5ml
细胞核蛋白抽提试剂C 2.5ml
PMSF(100mM) 0.2ml

功能属性

应用&特点一种简单、方便的抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。
约90分钟就可以完成细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。
抽提得到的蛋白可以用于Western,EMSA等后续操作。
运输方式蓝冰运输.
储存条件-20℃保存,一年有效。
用途仅供研究使用!不能用于人体。