MNI-caged-L-glutamate

本方案仅提供指导，实际应用应根据您的需要进行修改。

以一种改良的紫外线 (UV) 光诱导谷氨酸释放程序为例^[1]。

1. 溶液准备：

（1） 制备用于解剖的人工脑脊液 (ACSF)，以 mM 为单位：125 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl₂、6 MgCl₂、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃ 和 20 葡萄糖（充入 95% 氧气和 5% 二氧化碳），pH 值为 7.4。

（2） 准备用于实验的ACSF，以 mM 为单位：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃ 和20 葡萄糖（充入 95% 氧气和 5% 二氧化碳），pH 值为 7.4。

（3） 制备细胞内溶液 (ICS)，以 mM 为单位，其成分为：150 KMeSO₃、12.5 羟乙基哌嗪乙烷磺酸 (HEPES)、40 KCl、5 NaCl、1.25 乙二醇四乙酸 (EGTA)、5 Mg-ATP、0.5 Na-GTP。将 pH 值调整至 7.3。将 溶液1 ml 的等分试样储存在 -20 °C 下。

（4） 在双蒸水中稀释钠结合苯并呋喃间苯二甲酸酯 (SBFI) 盐，并制备 5 µl 10 mM 储备溶液的等分试样。

（5） 解冻 ICS 并添加 SBFI 原液，使最终浓度为 1 mM。涡旋并微滤（0.22 µm）。保持在 4 °C 直至用于实验。请勿重新冷冻，且当天使用完毕。

（6） 将化合物溶解在双蒸水中，制备 50 mM 的 MNI-caged-L-glutamate储备溶液。将 MNI-caged-L-glutamate储备溶液稀释至正常 ACSF 中使其最终浓度为 5 mM。在实验中使用前，请将其保存在 4 °C 下。请勿重新冷冻，且当天使用完毕。将未立即用于实验的等分试样保存在 -20 °C 下。

2. 组织解剖

（1） 小鼠斩首后，迅速将大脑从头骨中取出。

（2） 立即将大脑放入带有冰冷解剖液 ACSF 的培养皿中，并沿中线进行矢状切割来解剖半球。

（3） 按照所需方向进行第二次切割作为阻挡面，然后用强力胶将其附着到振动切片机的切割台上。

（4） 将振动切片机的切割室和冷却元件（均保持在 -20 °C）从冰箱中取出，并将带有脑切片的切割台放入切割室中。然后将冷却元件放入切割室中，并将组织浸入冰冷解剖液 ACSF 中。为了稳定制备物，可能需要用琼脂凝胶固定组织块。

（5） 使用振动切片机将海马体切成 250 µm 厚的旁矢状切片。确保所有 ACS 液体调整过PH。

（6） 切片后，将组织放在装有正常ACSF的烧杯中的网上，在34°C下孵育30分钟。然后放在室温下。

3. 硬件准备

（1） 打开多光子系统组件。测试并调整红外激光束。

A： 通过翻转定心棱镜而不是物镜来控制光束定位。如果光束错位，请使用潜望镜中的镜子重新调整。注意，成像时棱镜的定心平面必须与物镜的后焦平面处于同一水平。

B：打开光谱仪并检查光束的多光子特性。

C：将成像软件的参数设置为以下值：为细胞的概览图像选择 512 x 512 像素的帧大小（较小的剪辑框，缩放系数为 2.5，分别用于高帧速率和高空间分辨率）。将成像速度设置为快速模式，将扫描模式设置为 XYT。概览堆栈的 Z 步进应为 1 µm，详细堆栈的 Z 步进应为 0.2 µm，以满足稍后执行反卷积的空间采样要求

（2） 通过改变Pockels单元的设置（物镜下的最终功率：≈14 - 16μW）和光电倍增器（PMT）来调整多光子激光束（790nm）强度。

（3） 通过在物镜下方放置荧光样品载玻片来打开并校准开笼系统。

A：使用双筒望远镜，调整紫外线光学系统的焦点，并通过使用 UGA 扫描头上的聚焦装置，将紫外线激光点在空间上限制为最大直径 2 µm 的大小。

B：启动解笼装置控制软件的校准程序。

C：通过解笼锁点和成像计算机之间的网络连接导入成像系统的图像，实现了解笼锁点的精确定位。

D：打开微操作器、电生理学组件和压力应用装置，将MNI-caged-L-glutamate化合物输送到目标区域。

E：安装一个局部压力应用装置，用于局部灌注MNI-caged-L-glutamate化合物。与这些物质的浴灌注相比，这将大大降低成本。将保持压力调整为给定的大气压力，以防止 ACSF 拖入或MNI-caged-L-glutamate物质从应用移液器中泄漏。

注：压力施加装置在移液器支架中装有高精度超快微型阀。这样可以采用最小施加压力，从而将MNI-caged-L-glutamate化合物局部灌注过程中的运动伪影降至最低。

F：使用抛光硼硅酸盐玻璃毛细管拉出移液器进行全细胞膜片钳和局部灌注。移液器的尖端直径应为 ~1 µm，电阻应为 R ≈ 3 MΩ（使用基于 K-MeSO₃ 的 ICS 确定的值）。

G：将切片放入实验槽中，并用网格固定（厚度为 250 µM 的铂框架，用外科细丝覆盖，外径为 40 µm）。使用倒置、尖端断裂且经过火抛光的巴斯德吸管（吸球位于断裂尖端的一侧）进行切片转移。避免弯曲或对切片进行任何其他粗暴处理。

H：将浴槽置于显微镜台上，并用 ACSF 永久灌注切片。

4. 全细胞膜片钳

（1） 将含有 SBFI 的 ICS 装入膜片移液器，将MNI-caged-L-glutamate化合物装入局部灌注移液器。将移液器连接到相应的微操作器上。将参比电极放入槽中。确保您永久接地，以免损坏头部。

（2） 将两个吸液管放入水浴中，并将它们放置在海马 CA1 区上方。对膜片吸液管施加轻微压力 (+40 mbar)，以避免 ICS 被 ACSF 稀释。

（3） 使用电生理学软件补偿膜片吸管的偏移电位。

（4） 使用 IR-DIC 视频显微镜用膜片吸管接近 CA1 锥体细胞。轻轻吸气，直到获得 Giga 密封。选择胞体位于切片表面以下 30 -70 µm 的细胞，一方面确保细胞形态完整，另一方面确保解笼光束的低散射和衰减。

（5） 补偿快速容量。打破膜并打开细胞以获得全细胞结构。

（6） 补偿缓慢的容量和串联电阻。

（7） 在开始成像实验之前，让细胞用 SBFI-ICS 透析至少 30 分钟。

5. 多光子成像和刺激

（1） 向ACSF中加入河豚毒素（TTX，500nM）以防止电压门控钠通道的激活和动作电位的产生。

（2） 使用多光子激发和产生的 SBFI 荧光可视化细胞形态，并选择多刺枝晶进行实验。以更高分辨率放大图像，并在树突周围放置一个剪辑框。

（3） 用含有MNI-caged-L-glutamate的10μl ACSF填充标准贴片移液器。将移液器连接到压力应用系统，并将其连接到显微操纵器。

（4） 将装有MNI-caged-L-glutamate化合物的移液管放在枝晶附近（~30μm）。放置移液器，以便对所选的枝晶进行有效的局部灌注。调整解笼激光器：将解笼点放置在靠近目标结构 （~1 - 2 μm） 的位置。

（5） 使用成像软件在选定的枝晶和相邻的棘上设置感兴趣的区域。

（6） 接近感兴趣的区域，并用低压 （<3 PSI） 集中注射MNI-caged-L-glutamate化合物几秒钟。通过触发信号开始膜片钳和荧光记录（在 790 nm 多光子激发下）。

注：在MNI-caged-L-glutamate的局部灌注过程中，激发束完全变暗以防止漂白。

（7） 停止MNI-caged-L-glutamate化合物的局部灌注。增加双光子激光器的强度以实现 SBFI 的有效激发，并应用紫外线闪光灯来初始化解笼（解笼持续时间 300 毫秒）。

（8） 监测SBFI荧光的变化。在SBFI荧光恢复到基线后停止记录。

References:

[1] Kleinhans C, Kafitz KW, Rose CR. Multi-photon intracellular sodium imaging combined with UV-mediated focal uncaging of glutamate in CA1 pyramidal neurons. J Vis Exp. 2014 Oct 8;(92):e52038. doi: 10.3791/52038.