LysoTracker Deep Red

使用方法

使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简单低速离心使溶波降至管底，第一次使用请将本品按单次用量分装保存，<-20℃避光干燥保存，尽量避免反复冻融。最佳工作浓度需根据不同的实验要求、细胞类型、细胞或组织的膜通透性等进行优化。

1.工作液的配制

利用生长培养基或合适的缓冲液将1mM储存液稀释至工作浓度，工作波需现配现用。对于Lysotracker系列溶酶体探针，推荐工作液浓度为50-75nM；

【注意】:
1)为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。

2)若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育，会观察到荧光信号的衰减和细胞的空泡化现象。

2.染色步骡(贴壁细胞)

1)将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。

2)待细胞生长到合适密度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针培养基(必须完全覆盖住细胞)，在适合特定细胞类型的生长条件下孵育细胞30min-2h(具体孵育时间需根据细胞类型而定)。

3)利用不含探针的新鲜培养基替换上述染色液，并目用装有合适滤片的荧光是微镜进行观察。若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间，使得染料能聚集在溶酶体上。

【注意】:

对Lysotracker Green DND-26的内化(Internalization) 进行动力学研究发现，活细胞摄取此探针的速率在几秒之内即可完成。然而严重不足的是，该探针展示出溶酶体“碱化效应”，从而，长时间孵育会导致溶酶体pH上升。因此，仅仅当此探针于37C孵育细胞1-5min，才是有用的pH指示剂。

3.染色步骤(悬浮细胞)

1)离心沉淀细胞，吸除上清。

2)利用适量 37℃预热的含探针培养基重悬细胞，在适合待定细胞类型的生长条件下孵育细胞30min-2h(具体孵育时间需根据细胞类型而定)

3)离心，吸除染色液，加入新鲜培养基重悬细胞。

4)用装有合适滤片的荧光显微镜进行观察。若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间，使得染料能聚集在溶酶体上。

【注意】:

另一种方法，悬浮细胞可能会粘附到经BD Cell-Tak处理的盖玻片上，此时，可用类似于贴壁细胞的方法进行染色。

注意事项

1) 整个操作过程中注意避光。

2)为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。