Enhanced Potassium Green-2 AM (EPG-2 AM)

以下步骤仅做参考，具体请根据实际情况或参考文献资料来调整。
1.1 使用无水DMSO溶解EPG-2 AM(Mw:1128.02 g/mol)配制成1-5mM储存液，比如往50μg EPG-2AM冻干粉内加入22μlDMSO，充分溶解后配制成2mM
储存液。-20°C分装干燥冻存，避免反复冻融。
1.2 通常在含适当浓度AM探针的无血清培养基中实现探针加载。建议正式实验前向加载培养基内加入PluronicF-127以促进AM探针的分散。可用DMSO配置20% P
luronic F-127储存液或其他浓度，只需在正式实验前将其与EPG-2AM储存液混合，然后加入加载培养基，保证其终浓度<0.1%(w/v)。
1.3室温或37C孵育细胞(可能在室温的探针加载质量会高些)，孵育浓度通常为1-10μM，孵育时间通常为30-60min，具体的请根据实际情况或参考文献资料。
1.4 [可选]对于大分子量AM探针(分子量≥1000g/mol)，孵育结束，加入不含AM探针的细胞加载培养基额外孵育20-60min，以确保细胞将AM基团完全去醋化。
1.5 用不含血清和探针的培养基清洗细胞至少一次，以降低细胞外背景荧光。
1.6 最后用合适的仪器来检测荧光信号。检测用最大激发波长517nm，最大发射波长540nm。

[注意]:
a)如果细胞加载培养基是以碳酸氢钠为缓冲体系，那么加载需要含5%CO2的环境内进行，以防止因CO2损失引起的培养基碱化。
b)如果细胞加载培养基含血清，那需适当提高AM探针工作浓度，以补偿因AM探针与血清蛋白结合引起的损失。
c)某些情况下，对分子量接近或超过1000的AM探针，需用不含AM探针的细胞加载缓中液进一步孵育20-60min，以保证细胞内酯酶能充分降解AM基团。 d)探针的加载时间和浓度因具体的细胞类型而有差异，请根据具体的细胞类型来优化。
e) 对每一种探针有必要通过校准(calibration)来得到实际解离常数(Kd)。物理条件如温度，pH，离子强度或溶液粘度，以及探针与细胞组成成分如蛋白质的
相互作用，都会影响Kd值。实际情况细胞内的Kd比体外溶液通常要高。因此，细胞水平研究有必要进行校准确认实际Kd值。
f)对于EPG-2，虽然最大激发波长在517m，但其极强的荧光亮度使其能够用标准的488nm滤片来激发，与Fluo系列的可见光钙离子指示探针检测手段一致。值得
注意的是，488nm激发下得到的荧光强度约为最大激发波长下的40%。

注意事项
1) EPG-2AM易受潮，粉末需干燥保存;粉末需用无水DMSO溶解，配制储存液(如10mM)，置于-20℃干燥避光保存，小量分装避免反复冻融，至少3个月稳定。
2)为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。