Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit
目录号 : GK10045GLPBIO生产的细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit）能够通过碘化丙啶染色(Propidium staining; PI staining)对细胞周期及细胞凋亡情况进行分析，适用于悬浮细胞、贴壁细胞及消化成单细胞状态的组织细胞的检测。
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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GLPBIO生产的细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit）能够通过碘化丙啶染色(Propidium staining; PI staining)对细胞周期及细胞凋亡情况进行分析，适用于悬浮细胞、贴壁细胞及消化成单细胞状态的组织细胞的检测。
PI是一种红色荧光探针，与双链DNA结合后可产生荧光，且荧光强度与双链DNA的含量成正比。PI不能被动进入具有完整质膜的细胞，所以PI的摄取与排除可用于区分活死细胞。PI能够被400-600nm之间的波长激发，发射波长是600-700nm。水溶液中PI的最大激发/发射波长是493/636nm，结合核酸后的最大激发/发射波长为535/617nm。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度理论上则为2，正在进DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2。细胞发生凋亡时，由于细胞核皱缩和DNA片段化，部分基因组DNA片段在染色过程中丢失，在PI染色后荧光强度会小于1，经流式细胞仪检测后会出现sub-G1峰，即凋亡细胞峰。
另外，细胞在发生凋亡时，细胞的光散射情况也会发生变化。在凋亡早期，染色质皱缩，细胞密度增加，细胞对前向角光散射的能力显著降低，而对侧向角光散射能力增加或不变；到了凋亡晚期，细胞产生凋亡小体，前向角和侧向角光散射的信号均会降低。基于本试剂盒，通过流式细胞仪能够对细胞DNA含量及光散射情况进行检测。
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1. 细胞收集
(1). 悬浮细胞：收集约105-106个细胞，4℃、1000g离心3-5min，小心吸弃上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞，并转移到1.5mL离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸弃上清，可以残留约50μL左右的PBS，以避免吸走细胞。
(2). 贴壁细胞：将细胞培养液吸出，转移至合适大小的离心管内。使用PBS轻柔清洗一次贴壁培养的细胞，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至细胞形状逐渐变圆并变得松散、轻轻晃动出现细胞脱落时，立即向消化好的细胞中加入收集的细胞培养液终止消化，将细胞轻柔吹打下来，收集到同一离心管中。4℃、1000g离心3-5min，小心吸弃上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞，并转移到1.5mL离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸弃上清，可以残留约50μL左右的PBS，以避免吸走细胞。
(3). 组织细胞：用剪刀将组织剪成尽可能小的小块，加入胰蛋白酶消化0.5-1h，经200-400目筛网过滤得到单细胞悬液。取约105-106个细胞，4℃、1000g离心3-5min，小心吸弃上清，加入1mL预冷的PBS重悬细胞，并转移到1.5mL离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸弃上清，可以残留约50μL左右的PBS，以避免吸走细胞。
2. 细胞固定及漂洗
向细胞中加入1mL预冷的70%乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2h或更长时间。固定结束后，1000g离心3-5min收集细胞，小心吸弃上清，加入约1mL预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸弃上清。
注意：
(1). 建议固定2h及以上更能保证染色效果，固定12-24h效果更佳。
(2). 固定细胞时，也可以采用以下方案：先向细胞沉淀中加入300μL PBS，充分重悬吹散细胞后再加入700μL无水乙醇混匀，得到70%的乙醇固定液，可以避免细胞成团或粘连。
(3). 对于特定的细胞，如果固定后离心时细胞沉淀不完全，建议适当延长离心时间或加大离心力，直至细胞完全沉淀。
(4). 细胞固定后体积会变轻，离心时易悬浮，可以将PBS替换成含2% BSA的PBS，辅助细胞沉降。
(5). 去除固定液及漂洗细胞时，每次吸弃上清可保留约50μL左右的液体，避免吸弃细胞样本。
3. 细胞染色
(1). 参考下表，根据样本数量配置染色工作液：
|
|
1个样本 |
6个样本 |
12个样本 |
|
Cell Stain Buffer |
0.5mL |
3mL |
6mL |
|
PI Stain Buffer |
10μL |
60μL |
120μL |
|
RNase A |
10μL |
60μL |
120μL |
|
总体积 |
0.52mL |
3.12mL |
6.24mL |
注意：染色工作液建议现用现配，当天使用。
(2). 向每管细胞样品中加入0.5mL PI染色液，轻柔重悬细胞，37℃避光孵育30min。孵育结束后可以4℃或冰浴避光存放。建议尽快上机，最好在2-5h内完成样本的流式检测。
4. 流式检测
使用流式细胞仪检测荧光情况，并通过适宜的分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。PI结合核酸后的最大激发/发射波长为535/617nm。
注意：上机前可使用200-400目筛网过滤细胞悬液，得到分散的单个细胞。
| Components | 50 Tests |
| PI Stain Buffer | 500 μL |
| RNase A | 500 μL |
| Cell Stain Buffer | 25 mL |
| Storage: -20°C, protect from light | |