单个核糖核蛋白机器的体外标记策略

长期以来，大自然一直在利用大型生物分子组件将化学能转化为准机械运动 ，以执行生命的基本功能。例如，细胞利用翻译机器--核糖体--从mRNA模板中制造蛋白质。细 胞纳米机器通过使用miRNA来调节翻译的程度，以引导AGO蛋白组装成 RISC到 3' 非翻译区。 与其他机器类似，核糖核蛋白复合物 (RNP)需要正确组装正确数量和类型的分子才能发挥其功 能。 任何一个错误折叠或基因突变都可能导致功能丧失或异常并导致疾病。而细胞内单分子荧 光显微镜 (SMFM) 成像可用于探测单个机器组件在其细胞环境中的结构和活动。但缺乏高产率 方法来荧光标记 RNA 分子阻碍了SMFM的发展。

真核 mRNA 通常被视为分为四个功能片段：5' UTR（包括 m 7 G 帽）、22 、23编码序列、3 ' UTR和 poly(A) 尾。将荧光探针结合到这些片段中的任何一个都可能对 mRNA 的功能有害，可能导致虚假的发现和错误的结论。因此非常需要能够在 RNA 的确切位置 精确地结合可控数量的荧光团的标记策略。来自密歇根大学的化学生物学家利用 T7 RNA 聚合 酶和酵母poly(A) 聚合酶将修饰的核苷酸整合到 mRNA 的三个片段之一：随机进入体内（包括 5' UTR、编码区和 3' UTR），随机进入poly（A）尾，或特别是在身体和尾部（BBT）之间。在 修改和标记之后，使用生化和单分子荧光显微镜方法的组合，每种策略产生 mRNA 的能力都被 测试。

T7 RNA 聚合酶和酵母 poly(A) 聚合酶能够分别有效地标记mRNA的身体和尾部

为了标记萤火虫荧光素酶 (FLuc) 或海肾荧光素酶 (RLuc) mRNA，科学家们 使用酶标记法将两种化学修饰的三磷酸核苷 (CNTPs) 整合到 RNA 链中：使用 T7 RNA 聚合酶 共转录掺入Cy5-UTP （图 1A）以及转录后使用酵母poly(A)的聚合酶掺入叠氮基-ATP（图 1B） 。所有三种标记策略（图 1C）分别被应用于：1）将 Cy5-UTP 随机掺入整个 RNA [5' UTR，编 码序列和 3' UTR，（图 1C顶部）]；2）在主体和poly（A）尾之间添加连续的叠氮基-ATP（图 1C中部）；3）在整个 poly(A) 尾部随机掺入叠氮基-ATP （图 1C底部）。每一种策略都提供 了将荧光团放置在远离感兴趣区域的独特能力。

如果 T7 RNA 聚合酶在 5 位发生改变，它们就可以耐受CNTP。因此，用 Cy5-UTP 补充转录反应将允许萤火虫荧光素酶 mRNA 的共转录体标记 [FLuc，（图 1C顶部)]。 此外，在 0% Cy5-UTP 对照转录中观察到的副产物并没有增加（图2A）。 同时量化显示每个纯 化 RNA 分子的荧光团数量与转录过程中 Cy5-UTP 的分数之间存在线性相关性（图 2B）。这表 明通过调整转录混合物中 Cy5-UTP 的起始浓度可以很容易地预测和控制标记的程度。

在其身体和尾部之间标记 RNA （BBT，图 1B）确保 CNTP 被整合到功能相 关序列的外部。对于这种策略，首先转录 RNA，5’加帽，然后通过酵母poly (A) 聚合酶 （yPAP）用连续的叠氮基-ATP链修饰3’位置。在进一步多聚腺苷酸化（未经修饰）和纯化后， 使用Alexa647试剂和反应条件温和且产率高的SPAAC点击方法来标记 RNA。 凝胶分析表明 Alexa647 条带强度随着与 yPAP 和叠氮基 ATP 孵育的时间增加而增加（图 2C），导致特别是 在早期时间点的线性相关（图 2D）。

第三个策略是在poly（A）拖尾步骤期间随机掺入叠氮化物-ATP （图 1C底 部）。该策略旨在节省时间和必要步骤的数量，这在 RNA 产量较低时较为关键。通过使用带有 不同浓度的叠氮化物-ATP，并用Alexa647标记纯化的尾部修饰RNA后进行凝胶分析（图 2E）。 Alexa647 和RNA 的摩尔比与 ATP 池中的叠氮基-ATP 分数呈现线性相关性 （图 2F）。当需要 严格控制标记范围时，这种策略最佳。另外，为了评估掺入的 CNTP 对 poly(A) 拖尾的影响， 在 yPAP 介导的拖尾反应后，评估身体部位和 BBT 标记的 mRNA。结果显示无论标记的程度如 何，身体标记的 mRNA 很容易被拖尾，如 yPAP 处理后分子量的变化所示（图 2G）。而BBT 标 记策略中的叠氮基-ATP 修饰并没有阻碍 yPAP 进一步修饰具有典型 poly(A) 尾的 mRNA （图 2H）。

mRNA 的 BBT 和尾部标记与翻译兼容

为了测试荧光 mRNA 与全长翻译的兼容性，研究者用三种方法（Body = 60 标记/RNA、BBT = 17 标记/RNA 和 Tail = 4.7 标记/RNA）中的每一种对 FLuc mRNA 进行了大 量标记，并在能够进行翻译的兔网织红细胞提取物中孵育产生的 mRNA。为了检测所有的蛋白质 产物，该反应补充了 BIODIPY@ 标记的带赖氨酸的 tRNA (Fluoro-TectTM)，然后在梯度，4– 20% Tris-甘氨酸 SDS 凝胶上淬灭并分析所有分子量的荧光标记蛋白质。与对照相比，身体标 记的 mRNA 产生的 FLuc 蛋白减少了 72%（图 3A）， 表明该标记策略阻碍了核糖体功能。 而 BBT 和尾部标记都产生了强度在对照组 10% 以内的蛋白质条带（图 3B）。为了评估它们在纤 维素中的蛋白质编码能力，用重标记的 BBT（17 个标记/RNA）和尾部（4.7 个标记/RNA）修饰 的 FLuc mRNA 转染 HeLa 细胞，并测量它们的相对基因表达（图 3C）。结果显示标记 mRNA 的 FLuc 表达与未修饰的相比增加了大约两倍。将标记和未标记的 mRNA 显微注射到 U2OS 和 HeLa 细胞中，并通过免疫荧光检测 FLuc也得到相同结果（图 4A、B）。这些数据表明这两种 策略是标记 mRNA 并保持其编码功能的可行选择。

BBT 和尾标记 mRNA 的 3’ UTR 可用于 miRNA 调节

由于 miRNA 用于抑制翻译起始，由 miRNA 加载的 RISC 调节的 mRNA 靶标 相对于在其 3'UTR 中没有相应靶位点的对应物，具有抑制的蛋白质表达特征。研究者设计了一 组双荧光素酶报告质粒（RLuc 和 FLuc），该基因工程有 0、1、2、3、4、5、6 或 11 个 miR-7 miRNA 识别元件 (MRE) 位点来测试被标记mRNA 的 3'UTR 功能。用未标记的 mRNA 进行 的转染实验表明，随着 HeLa 和 DCP1a-EGFP 稳定转染的 U2OS 细胞中 MRE 数量的增加， miRNA 依赖性基因的抑制也增加。重要的是，将带有 0、1、3、6 或 11 个 miR-7 MRE 位点的 标记 FLuc BBT（~17 个标记/RNA）和尾部（~5 个标记/RNA）修饰的 mRNA 转染到 HeLa 细胞 中显示出相同的抑制特征增加（图 5A）。因此，这些荧光团的布局能够与 RISC 的 miRNA 依 赖性翻译起始抑制兼容。

mRNA 靶标的 miRNA 调节的另一个方面是其最终降解。 mRNA 去稳定化涉及 去腺苷酶复合物（CCR4-Not1 和 PAN 2/3）的募集，用于缩短 poly(A) 尾、DCP1/2 脱帽复合 物和 XRN1 依赖性 5'-to-3' mRNA 消化。这些不稳定过程被认为部分发生在大的细胞质聚集体 中，称为处理体 (P-Bodies)。因此，将目标 mRNA 募集到 P-Body 颗粒通常被视为降解的标志 。研究者还创建了一个稳定转染并表达与 EGFP 嵌合连接的 DCP1a 蛋白的 U2OS 细胞系并在注 射后 2 小时评估显微注射的标记 mRNA 与 EGFP-DCP1a 共定位的程度（图 5B）。2 小时后， 在 P-Body 质心的 4 像素半径内对活细胞进行 Alexa647 病灶成像，持续时间超过 9 帧（0.9 秒）。 在这个阈值下，在存在 miR-7 的情况下，无论标记策略如何，都发现 约50% 的 P- Bodies 与 Alexa647 标记的 mRNA 共定位（图 5B、C）。相反，在没有 miR-7 的情况下，发 现平均10% 的 P-Bodies 与 mRNA 共定位（图 5B、C）。 综上，使用所有三种标记策略， mRNA 的 3' UTR 仍然可用于 miRNA 依赖的 RNA 沉默。

总结

研究者们系统地测试和验证了两种酶促方法，将化学修饰的核酸 (CNTP) 在 体外策略性地整合到 mRNA 分子的三个选定区域之一：身体、身体和尾部之间 (BBT) 以及整个 尾部。每种策略都具有其独特性，可以根据实验需要将荧光团放置在 RNA 分子的不同区域内。 他们使用了两种酶：T7 RNA 聚合酶和酵母poly (A) 聚合酶 (yPAP)。对于身体标记，T7 RNA 聚合酶将包含 5 位修饰的嘧啶，例如 Cy5-UTP。对于 BBT 和尾部修饰方法，yPAP可以有效地 在 ATP 的 2' 位置掺入小的修饰，例如叠氮基-ATP。通过将修饰的 RNA 与SPAAC荧光点击试剂 一起孵育，可以快速、温和地完成叠氮基部分的荧光团标记。使用 T7 RNA 聚合酶对 RNA 分子 进行共转录体（5' 到 3' UTR）标记是高效且高产的，但可产生非编码的mRNA。为了正确翻译 可行的蛋白质，翻译机器的高度加工成分必须不受阻碍地遍历编码序列。另外两种策略，BBT 和尾部标记，既高效又高产，并且在蛋白质编码和 miRNA 介导的调节方面与未修饰的对应物无 差别。