Autophagic Flux Assay Kit
目录号 : GC26764自噬为蛋白质和细胞器等细胞质内成分自主降解的过程，研究发现它在衰老、神经退行性疾病等研究中发挥了重要的作用。
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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自噬为蛋白质和细胞器等细胞质内成分自主降解的过程，研究发现它在衰老、神经退行性疾病等研究中发挥了重要的作用。随着研究的深入，很多研究者需要确认自噬过程与自噬诱导或自噬溶酶体的抑制的关系，因此自噬流的研究至关重要。
本试剂盒包含了自噬体和自噬溶酶体检测染料（DAPRed）和自噬体检测染料（DALGreen）和溶酶体酸化抑制剂（bafilomycin A1），可准确的检测早期自噬的行程、自噬溶酶体与最终的消化降解过程。[1]
本试剂盒包含用于检测自噬体和自噬溶酶体的(DAPRed - Autophagy Detection）、用于检测自噬溶酶体的 (DALGreen - Autophagy Detection)和溶酶体酸化抑制剂 Bafilomycin A1，只需添加这几款试剂，就能实验自噬体形成到自噬溶酶体的全过程。[2][3]
References:
[1] H. Sakurai, et al., "Development of small fluorescent probes for the analysis of autophagy kinetics“, iScience, 2023, 26, 107218.
[2] X. Chen, et al, "Chaiqi decoction ameliorates vascular endothelial injury in metabolic syndrome by upregulating autophagy, Am J Transl Res., 2020, 12(9):4902-4922.
[3] C. Oh, et al, "S-Nitrosylation of p62 Inhibits Autophagic Flux to Promote α-Synuclein Secretion and Spread in Parkinson's Disease and Lewy Body Dementia, J Neurosci., 2022, 42(14), 3011-3024.
实验例1、使用共聚焦显微镜观察Bafilomycin A1对自噬溶酶体形成的抑制作用
使用DALGreen和DAPRed标记HeLa细胞，用以评估溶酶体酸化抑制剂Bafilomycin A1 (Baf. A1)对自噬流的影响。荧光检测，与饥饿处理组相比，添加了Baf. A1的处理组，抑制了自噬溶酶体的生成，DALGreen荧光强度降低。与之相反，DAPRed的荧光生成并无差异。实验结果显示Baf. A1可导致自噬体的积累与停滞。
*Bafilomycin A1的浓度、刺激时间与添加的时间点可能会对最终成像结果有影响，建议参考网页中“常见问题Q&A”中的Baf. A1处理部分。
<实验条件>
CTRL：阴性组，STV.：饥饿处理诱导自噬组，Stv.+Baf. A1:自噬溶酶体抑制组
DALGreen 荧光设置：488 nm (Ex), 490–550 nm (Em)
DAPRed 荧光设置：561 nm (Ex), 565–700 nm (Em)
<操作步骤>
1.将密度为1.0*104/孔的HeLa细胞接种在μ-slide 8孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。
2.使用MEM（10%胎牛血清）清洗2次后，加入200 μl的DALGreen/DAPRed混合工作液（DALGreen: 1 µmol/l, DAPRed: 0.2 µmol/l），37℃孵育30 min。
3.弃上清后使用MEM（10%胎牛血清）清洗2次。
4.样本制备参照下方条件。
·孔板中添加200 μl的MEM（10%胎牛血清），37℃培养2小时20分钟。（Control组）
·孔板中添加200 μl的无氨基酸培养基37℃培养2小时20分钟。（饥饿诱导自噬组）
·孔板中添加200 μl的无氨基酸培养基，37℃培养2小时后，弃上清，加入溶酶体酸化抑制剂bafilomycin A1工作液200 μl，37℃培养20分钟。（自噬溶酶体抑制组）
5.在激光共聚焦显微镜下检测细胞。
实验例2、使用激光共聚焦显微镜观察3-MA对自噬体形成的抑制作用
使用DALGreen和DAPRed标记HeLa细胞，用以评估自噬抑制剂3-MA对自噬流的影响。荧光检测，与饥饿处理组相比，添加了3-MA的处理组，DALGreen和DAPRed的荧光强度降低，证实了3-MA会抑制自噬体的生成。
*3-MA的刺激时间与添加的时间点可能会对最终成像结果有影响，建议参考网页中“常见问题Q&A”中的3-MA处理部分。
<实验条件>
CTRL：阴性组，STV.：饥饿处理诱导自噬组，Stv.+3-MA:自噬体抑制组
DALGreen 荧光设置：488 nm (Ex), 490–550 nm (Em)
DAPRed 荧光设置：561 nm (Ex), 565–700 nm (Em)
<操作步骤>
1.将密度为1.0*104/孔的HeLa细胞接种在μ-slide 8孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。
2.使用MEM（10%胎牛血清）清洗2次后，加入200 μl的DALGreen/DAPRed混合工作液（DALGreen: 1 µmol/l, DAPRed: 0.2 µmol/l），37℃孵育30 min。
3.弃上清后使用MEM（10%胎牛血清）清洗2次。
4.样本制备参照下方条件。
·孔板中添加200 μl的MEM（10%胎牛血清），37℃培养2小时20分钟。（Control组）
·孔板中添加200 μl的无氨基酸培养基37℃培养2小时20分钟。（饥饿诱导自噬组）
·孔板中添加200 μl的无氨基酸培养基，37℃培养2小时后，弃上清，加入200 μl无氨基酸培养基配制的3-MA（10 mmol/l，自噬抑制剂）工作液，37℃培养20分钟。（自噬体抑制组）
5.在激光共聚焦显微镜下检测细胞。
实验例3、使用激光共聚焦显微镜观察E64d/Pepstatin A对溶酶体蛋白酶的抑制作用
使用DALGreen和DAPRed标记HeLa细胞，用以评估溶酶体蛋白酶抑制剂E64d/Pepstatin A（Pep A）对自噬流的影响。荧光检测，与饥饿处理组相比，添加了E64d/Pep A的处理组，DALGreen和DAPRed的荧光强度增加，证实了E64d/Pep A可导致自噬溶酶体的增加。
<实验条件>
CTRL：阴性组，STV.：饥饿处理诱导自噬组，Stv. + E64d/Pep A: 溶酶体蛋白酶抑制剂组
DALGreen 荧光设置：488 nm (Ex), 490–550 nm (Em)
DAPRed 荧光设置：561 nm (Ex), 565–700 nm (Em)
<操作步骤>
1.将密度为1.0*104/孔的HeLa细胞接种在μ-slide 8孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中过夜培养。
2.使用MEM（10%胎牛血清）清洗2次后，加入200 μl的DALGreen/DAPRed混合工作液（DALGreen: 1 µmol/l, DAPRed: 0.2 µmol/l），37℃孵育30 min。
3.弃上清后使用MEM（10%胎牛血清）清洗2次。
4.样本制备参照下方条件。
·孔板中添加200 μl的MEM（10%胎牛血清），37℃培养2小时。（Control组）
·孔板中添加200 μl的无氨基酸培养基37℃培养2小时。（饥饿诱导自噬组）
·孔板中加入200 μl无氨基酸培养基配制的 E64d/Pep A (10 µg/ml each，溶酶体蛋白酶抑制剂）工作液。（溶酶体蛋白酶抑制剂组）
5.在激光共聚焦显微镜下检测细胞。
| 应用&特点 | ● 无需转染，添加试剂即可轻松检测自噬流
● 试剂盒包含实验所需的溶酶体酸化抑制剂 |
| 运输方式 | Ship with Room temperature. |
| 储存条件 | -20°C, protected from light, stored in nitrogen |
| 用途 | 仅供研究使用!不能用于人体。 |