Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit
目录号 : GK10037Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit是一种使用FITC标记的Annexin V蛋白来检测细胞凋亡水平的凋亡检测类试剂盒。
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
本方案仅提供一个指导,请根据您的具体需要进行修改。
一、 细胞悬浮染色:
1、悬浮细胞染色
(1)细胞经1000g离心5分钟,弃上清,用适量PBS轻轻重悬细胞并计数。
注意:PBS重悬细胞也起到了洗涤细胞的作用,可以保证后续Annexin V-FITC的结合不受干扰,此步骤不可省略。
(2)取约5-10×104个细胞,1000g离心5分钟,弃上清,加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。
(3)加入5μl Annexin V-FITC和10μl Propidium Iodide染色液,轻柔混匀。
(4)室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。
注意:孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
(5)将样本转移至冰浴中,建议使用铝箔避光处理。
(6)使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。
2. 对于贴壁细胞的消化后检测:
(1)(重要)将细胞培养基吸出,转移至合适大小的离心管内。
(2)(关键)使用PBS轻柔清洗一次贴壁培养的细胞,加入适量胰酶细胞消化液消化细胞,室温孵育至细胞形状逐渐变圆并变得松散、轻轻晃动出现细胞脱落,立即向消化好的细胞中加入步骤(1)收集的细胞培养基终止消化,将细胞轻柔吹打下来。
注意:
① 建议在此步骤使用步骤(1)中收集的细胞培养基终止消化,也能够收集悬浮在培养基的发生凋亡或坏死的细胞。
② 胰酶消化需要适当。消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜损伤,从而导致细胞坏死的假阳性;消化时间如果过长,同样易造成细胞膜损伤而出现假阳性,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合,从而干扰对细胞凋亡的检测。
③ 胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA。Annexin V是Ca2+依赖的蛋白,EDTA可以螯合Ca2+,从而影响Annexin V和磷脂酰丝氨酸(PS)结合,影响实验结果。
④ 如果使用含EDTA的胰酶消化细胞,建议在消化结束后、加Annexin V-FITC前使用PBS多清洗几次细胞,能够去除EDTA对凋亡检测的影响。
(3)将细胞液转移至离心管中,1000g离心5分钟,弃上清,收集细胞,用PBS轻轻重悬细胞并计数。
注意:此步骤应尽量去除胰酶,残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC,影响染色效果。
(4)取约5-10×104个细胞,1000g离心5分钟,弃上清,加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。
(5)加入5μl Annexin V-FITC和10μl Propidium Iodide染色液,轻轻混匀,室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。
注意:孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
(6)将样本转移至冰浴中,建议使用铝箔避光处理。
(7)使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。
二、贴壁细胞的原位荧光检测:
1、(选做)如果条件允许,建议在凋亡诱导结束后将多孔板经1000g离心5分钟。
2、吸弃细胞培养基,加入PBS洗涤一次。如果条件允许,建议在吸弃PBS前将多孔板经1000g离心5分钟。
3、加入195μl Annexin V Binding Buffer。
4、加入5μl Annexin V-FITC和10μl Propidium Iodide染色液,轻轻混匀,室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。
5、将样本转移至冰浴中,建议使用铝箔避光处理。
6、使用荧光显微镜对染色结果进行检测。
注意事项:
1、 细胞在染色后应尽快检测,建议在1小时之内完成检测,不建议将细胞在结合液中保存过久。
2、 如果用于流式细胞仪检测,可立即上机检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,最大激发光/发射光波长为525/530nm,也能够使用488通道激发;碘化丙啶(PI)为红色荧光,结合核酸后的最大激发光/发射光波长为535/617nm。
3、 染色完成后可以不更换掉染色液,直接上机检测。如果不能立即检测,建议离心去除染色液,使用PBS或Annexin V Binding Buffer重悬细胞。
4、 如果细胞在悬浮染色后使用荧光显微镜检测,建议1000g离心5分钟收集细胞,使用50-100μl Annexin V Binding Buffer轻轻重悬细胞,涂片后在荧光显微镜下观察。
5、 在初次使用流式细胞仪进行检测时,建议设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染3组对照。
6、 在使用流式细胞仪进行检测时,如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞,并且通过调整相关设置和参数也无法改善,可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
7、 本产品只适用于细胞模型的凋亡双染,也适用于检测精子凋亡,但不能用于检测组织样本中的凋亡。
8、 Annexin V-FITC通过结合磷脂酰丝氨酸(PS)对凋亡细胞进行标记,PS在不同种属间相对保守,故而本产品适用于对不同种属的细胞进行凋亡检测,具体实验步骤可参考相关文献。
9、 本产品能够和抗体一起对细胞进行染色,但建议分开染色,建议在抗体染色完成后将缓冲液更换为Annexin V Binding Buffer进行凋亡检测。
10、 如果样品来源于血液,必须去除血液中的血小板,血小板中的PS会干扰实验结果。
11、 神经细胞膜容易破坏外翻,从而导致假阳性,所以本产品不适用于检测神经细胞的凋亡。
12、 操作中务必动作轻柔,离心后需确认管底是否有细胞。
13、 荧光染料均存在淬灭问题,实验过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
14、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit (Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒)是一种使用FITC标记的Annexin V蛋白来检测细胞凋亡水平的凋亡检测类试剂盒。
Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,广泛分布于真核细胞细胞浆内,参与细胞内的信号转导。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧;在细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸发生翻转,FITC标记的Annexin V能够与翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合,从而标记凋亡细胞。对于坏死细胞,由于细胞膜的完整性已经丧失,Annexin V-FITC可以进入到细胞浆内,与位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸结合,从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。通过流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备能够对凋亡情况进行检测。
本试剂盒也提供了碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液。碘化丙啶是一种能结合DNA的菲啶类荧光染料,可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞,呈现红色荧光,而活细胞和凋亡早期细胞则有碘化丙啶拒染的现象。
经Annexin V-FITC和PI联合染色后,正常细胞基本无荧光(Annexin V-/PI-),凋亡早期细胞呈绿色荧光(Annexin V+/PI-),凋亡晚期细胞及坏死细胞则呈绿色和红色荧光(Annexin V+/PI+)。
Components | 20 Assays(20T) | 50 Assays(50T) | 100 Assays(100T) |
Annexin V-FITC | 100 μL | 250 μL | 500 μL |
Propidium Iodide | 200 μL | 500 μL | 1 mL |
Annexin V Binding Buffer | 10 mL | 25 mL | 50 mL |
应用&特点 | ·结合效率高
·快速方便,仅需一步简单的染色程序,10-20分钟即可完成。 ·本试剂盒通过Annexin V-FITC和PI染色,可区分早期和晚期凋亡细胞及坏死细胞。 |
运输方式 | 蓝冰运输 |
储存条件 | 2-8℃,6个月有效。-20℃,1年有效。避光保存,避免反复冻融。 |
用途 | 仅供研究使用!不能用于人体。 |