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FerroOrange (Fe2+ indicator) Sale

目录号 : GC19943

活细胞亚铁离子Fe2+检测荧光探针(Ex:543 nm,Em:580 nm)

 FerroOrange (Fe2+ indicator)  Chemical Structure

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Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.

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产品文档

Quality Control & SDS

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实验参考方法

1.1 从冰箱取出FerroOrange,置于室温解冻,将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后,再开盖。

1.2 往一管FerroOrange(24μg)内加入35μL DMSO,用枪反复吹吸混匀,使其完全溶解制备1mM FerroOrange储存液。若单次不能用完储存液,请分装并置于-20℃避光保存,一个月内使用。

1.3 于正式实验前,用中性缓冲液或无血清培养基来稀释1mM FerroOrange储存液到所需工作浓度(比如:1uM),工作液需现配现用,尽快用完。【注意:酸性溶液会氧化FerroOrange,严重影响探针的效率】。

2. 荧光显微镜操作方法

2.1.细胞接种于荧光培养皿中,在37℃,5% CO2培养箱中孵育过夜。

2.2.弃去上清液,并用HBSS或无血清培养基洗涤细胞3次。

2.3.更换含有药物的培养基,在37℃,5% CO2培养箱中孵育。

* 请根据药物特性优化孵育时间。

2.4.加入浓度为1 μM的FerroOrange工作液,在37℃,5% CO2培养箱中孵育30分钟。

* 加入FerroOrange染色剂后直接观察,不要洗涤。

2.5.在荧光显微镜下观察细胞。

3. 流式细胞仪操作方法

3.1将1 x 105个HeLa细胞(MEM培养基,含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素)接种到6孔板中,并在37℃、5% CO2孵育箱中培养过夜。

3.2用无血清培养基(2 mL)三次洗涤细胞。

3.3向对照组细胞中加入无血清培养基(1 mL),硫酸铵亚铁处理组加入10mM的硫酸铵亚铁(10μL)(最终浓度:100μM)的无血清培养基。

3.4在37℃孵育箱中孵育细胞20分钟,并用HBSS(1 mL)三次洗涤细胞

3.5经胰蛋白酶消化(250 µL)后,用含血清的培养基(1 mL)停止反应,将1.25毫升的细胞悬液转移到微离心管中。

3.6 将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟。

3.7丢弃上清液,并向微离心管中加入HBSS(1 mL),通过振荡混合。

3.8将细胞悬液以1,500转/分的速度离心3分钟,并丢弃上清液。

3.9向细胞中加入1μM的FerroOrange和无血清培养基的MEM(300μL)。

3.10在37℃孵育箱中孵育细胞15-30分钟。

3.11染色细胞经过细胞过滤器过滤,并使用流式细胞仪分析样本。

4. 荧光检测

4.1对于荧光显微镜:通用的G激发滤片比如Cv3检测用的滤片。

4.2对于激光显微镜和流式细胞仪:532nm,514nm或561nm激光器用于激发。实在没有,亦可用488nm激光器。发射波长为580nm。

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图1 FerroOrange 染色硫酸亚铁铵处理的Hela细胞

5. 荧光酶标仪操作方法

5.1 进行组别设置

样品A:无添加剂(仅HeLa细胞)。

样品B:添加了铁螯合试剂2,2`-bipyridyl(Bpy)(GC61754)的HeLa细胞。

样品C:添加铁(硫酸铵铁)(GC20135)的HeLa细胞。

5.2 在96孔黑板(透明底)上接种100 µl HeLa细胞悬液,使其达到10,000 cells/well,在37℃  5% CO2 培养箱中过夜培养。

5.3 样品C的细胞用MEM(不含FBS)100 µl洗涤3次。

5.4 向样品C中添加100 μl硫酸铵铁(II)/MEM(不含FBS) (最终浓度: 100 µM),在37℃  5% CO2培养箱中静置30分钟。

5.5 用100 µl HBSS洗涤所有孔的细胞3次。

5.6 向样品A和C中添加100 μl的1 µM FerroOrange working solution ,向样品B中添加100 μl含有FerroOrange(最终浓度:1 µM)和Bpy(最终浓度:100 µM)的HBSS溶液,在37℃ 5%CO2培养箱中培养30分钟。

5.7 用多功能读板器检测各样品的荧光强度(Ex:543 nm,Em:580 nm)。

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图2 荧光酶标仪检测结果

 

注:该方案仅提供指导,应根据您的具体需求进行修改。

产品描述

铁是生物体内含量最丰富的过渡金属元素之一,参与多种生理过程活动。近年来,研究者广泛关注活细胞内游离铁的存在,游离铁以稳定的氧化还原态形式存在,主要为亚铁离子(Fe2+)和铁离子(Fe3+)。在研究细胞内的还原环境、金属转运蛋白和Fe2+的水溶性等方面,了解Fe2+的机制比Fe3+更为重要。FerroOrange是一种新型荧光探针,可用于活细胞内Fe2+的荧光成像,但不适用于死细胞。FerroOrange与Fe2+反应后的荧光强度上升不可逆。可用荧光显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等进行检测。

 

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图3  2 μl的1 mM FerroOrange和2 μl的10 mM的各种金属离子添加到1 ml的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中,并在室温下反应1小时后测得荧光强度。

 

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图4  FerroOrange 荧光性质(Ex/Em:543/580 nm)

 

 

常见问题Q&A:

Q1:FerroOrange由于是活细胞荧光探针,如果铁死亡发生,导致细胞膜破裂后,荧光是否存在?

A1:由于FerroOrange是活细胞探针,对死细胞无法发挥出探针的正常性能。

 

Q2: FerroOrange只会检测游离铁吗?还是某些如铁硫蛋白里的结合铁,都可以检测吗?

A2:FerroOrange只检测游离的二价铁

 

Q3: 有哪些帮助实验成功的技巧?

A3:(1)染色后不要清洗工作液,因为这样可能会让细胞内的FerroOrange泄露出来。

(2)为了获得更加可靠的实验数据,我们建议准备Bpy(2,2`联吡啶,抑铁剂)或硫酸亚铁铵(增铁剂)处理的细胞作为对照组,以便于FerroOrange的数据进行比较。

 

Q4: FerroOrange能否用于固定处理之后的样本?

A4:不能用于石蜡切片。

本试剂能尝试于温和条件下固定处理之后的样本,如多聚甲醛(PFA,终浓度3%)在4°C中培养10 min。与未固定的样本相比,固定20 min以上或室温固定后的样本的荧光强度会明显降低。请注意本探针可能很难于固定样本中使用,必须先进行染色,然后做尝试。

 

Q5:染色时需要注意什么?

A5:注意如下,

1.FerroOrange染色后的对培养基的更换。

染色后无需清洗工作液,通常血清中含有铁离子,请注意使用不含血清的培养基,所以染色后即使细胞外有残留的FerroOrange,但是因为细胞外没有血清中铁离子的影响,也不会产生背景荧光的问题。

 

2.细胞难以染色(灵敏度低)时的办法。

根据细胞种类的不同,染色程度也有差异。

使FerroOrange working solution浓度高于推荐的1 µM进行染色。建议在1-5 µM范围内染色。

 

Q6:推荐的滤光片

A6: 激发滤光片:530-565 nm

发射滤光片:570-620 nm

 

Q7: FerroOrange染色后是否有必要洗掉工作液?

A7:我们建议染色后不要清洗,因为这样可能会导致细胞中的FerroOrange泄露出来,荧光降低。

Chemical Properties

Cas No. SDF
分子式 分子量
溶解度 储存条件 Store at 2-8°C, protect from light
General tips 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液;一旦配成溶液,请分装保存,避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限:-80°C 储存时,请在 6 个月内使用,-20°C 储存时,请在 1 个月内使用。
为了提高溶解度,请将管子加热至37℃,然后在超声波浴中震荡一段时间。
Shipping Condition 评估样品解决方案:配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸:配备RT,或根据请求配备蓝冰。
  • 摩尔浓度计算器

  • 稀释计算器

  • 分子量计算器

质量
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浓度
x
体积
x
分子量
 
 
 
*在配置溶液时,请务必参考产品标签上、MSDS / COA(可在Glpbio的产品页面获得)批次特异的分子量使用本工具。

计算

动物体内配方计算器 (澄清溶液)

第一步:请输入基本实验信息(考虑到实验过程中的损耗,建议多配一只动物的药量)
给药剂量 mg/kg 动物平均体重 g 每只动物给药体积 ul 动物数量
第二步:请输入动物体内配方组成(配方适用于不溶于水的药物;不同批次药物配方比例不同,请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方)
% DMSO % % Tween 80 % saline
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